Fluoreszenzmarkierung Drosophila Herz Structures
Summary
Hier beschreiben wir eine grundlegende Protokoll für die Fluoreszenzmarkierung der verschiedenen Elemente des Herzens Rohre von Larven und erwachsenen<em> Drosophila melanogaster</em>. Diese Proben sind für die Bildgebung mittels Fluoreszenz-oder konfokalen Mikroskopie geeignet. Diese Technik ermöglicht detaillierte Strukturanalyse der Funktionen des Herzens von einem leistungsstarken Modell-Organismus.
Abstract
Die<em> Drosophila melanogaster</em> Dorsalen Gefäß oder Herz, ist eine röhrenförmige Struktur aus einer einzigen Schicht von kontraktilen Kardiomyozyten, Herzbeutel-Zellen, die an jeder Seite der Herzwand, unterstützende Alary Muskeln und bei Erwachsenen, eine Schicht der ventralen Längs-Muskelzellen align zusammen. Die kontraktilen Fasern Haus konservierte Bestandteile des Muskels Zytoarchitektur einschließlich dicht gepackte Bündel von Myofibrillen und Zytoskelett / submembranous Protein-Komplexe, die mit homologen Komponenten der extrazellulären Matrix interagieren. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Fixierung und die Fluoreszenzmarkierung insbesondere Myokardinfarkt Elemente aus den Herzen der sezierten Larven und semi-intakten, erwachsenen<em> Drosophila</em>. Insbesondere zeigen wir, die Kennzeichnung von Sarkomer F-Aktin und der α-Actinin in Larven Herzen. Darüber hinaus führen wir von F-Aktin und α-Actinin Kennzeichnung in Myosin-GFP-exprimierenden erwachsenen Fliegen und der α-Actinin und pericardin, eine Typ-IV-Kollagen der extrazellulären Matrix, in Wildtyp erwachsenen Herzen. Besonderes Augenmerk wird auf einer Montageplatte Strategie für semi-intakten, erwachsenen Herzen, die Handhabung minimiert und optimiert die Möglichkeit zur Aufrechterhaltung der Integrität des Herz-Rohren und dem dazugehörigen Gewebe gegeben. Diese Präparate eignen sich für die Bildgebung mittels Fluoreszenz-und konfokale Mikroskopie. Insgesamt ermöglicht dieses Verfahren eine sorgfältige und detaillierte Analyse der strukturellen Merkmale des Herzens von einem leistungsstarken genetisch manipulierbaren Modellsystem.
Protocol
Discussion
Hier präsentieren wir ein Protokoll, die zur Herstellung und Färbung der Drosophila melanogaster dorsalen Gefäß und der dazugehörigen Gewebe für die Bildgebung mittels Fluoreszenz-oder konfokalen Mikroskopie. Wir bieten eine übersichtliche Darstellung der Schritte verfeinert und am häufigsten in unserem Labor für eine effektive Färbung, die gut aufgelösten erlaubt in situ Darstellung von Larven und erwachsenen Drosophila Herzen Rohre eingesetzt. Andere haben ähnliche Methoden in ab…
Acknowledgements
Die Autoren danken SI Bernstein (San Diego State University) für die kritische Durchsicht und Anregungen in Bezug auf die Erstellung des Manuskripts. Diese Arbeit wurde vom NIH gewährt SI Bernstein, SDSU, und R. Bodmer, BIMR unterstützt, und durch ein Postdoc-Stipendium von der Western States Partner der American Heart Association zu G. Vogler und A. Cammarato.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Ethylene glycol-bis (2-amino-ethylether) -N,N,N’,N’-tetra-acetic acid (EGTA) | Reagent | Sigma-Aldrich® | E4378 | |
| Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Reagent | Polysciences Inc. | 50-00-0 | |
| Triton-X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich® | 9002-93-1 | |
| Alexa Fluor® 594 phalloidin | Reagent | Invitrogen™ | A12381 | |
| Vectashield® Mounting Medium for Fluorescence with DAPI | Reagent | Vector Laboratories, Inc. | H-1200 | |
| Tungsten pins | Reagent | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Pin holder | Reagent | Fine Science Tools | 26018-17 |
Referências
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