תיוג של פלורסנט תסיסנית לב מבנים
Summary
כאן אנו מתארים פרוטוקול בסיסי תיוג הניאון של אלמנטים שונים של צינורות הלב של הזחל והמבוגר<em> תסיסנית melanogaster</em>. דגימות אלו הן היטב מתאים דימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי או confocal. טכניקה זו מאפשרת ניתוח מבני מפורט של התכונות של לבבות מן אורגניזם מודל עוצמה.
Abstract
<em> תסיסנית melanogaster</em> כלי הגבי, או לב, הוא מבנה צינורי מורכבת בשכבה אחת של cardiomyocytes כויץ, תאים קרום הלב כי ליישר משני צדי הקיר הלב, השרירים כנפי תומכת, אצל מבוגרים, שכבת הגחון לתאי שריר האורך. בית סיבי התכווצות שימור מרכיבי cytoarchitecture השריר כולל חבילות בצפיפות של myofibrils ו קומפלקסים חלבונים cytoskeletal / submembranous, אשר אינטראקציה עם הומולוגיים הרכיבים של המטריצה תאיים. כאן אנו מתארים פרוטוקול קיבעון ואת תיוג פלורסנט של אלמנטים שריר הלב בפרט מלב הזחלים גזור למחצה שלם מבוגר<em> תסיסנית</em>. באופן ספציפי, אנחנו מדגימים את התיוג של sarcomeric F-אקטין של α-actinin בלב הזחל. בנוסף, אנו מבצעים תיוג של ה-F-אקטין α-actinin שרירן ב-GFP להביע זבובים בוגרים של α ו-actinin pericardin, סוג IV תאי מטריקס קולגן, בלב מבוגר בר סוג. תשומת לב מיוחדת ניתנת אסטרטגיה הרכבה למחצה שלם לבבות מבוגר זה ממזער טיפול מייעל את ההזדמנות לשמירה על שלמות הצינורות לב הרקמות קשור. תכשירים אלה מתאימים עבור דימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal. ככלל, הליך זה מאפשר ניתוח זהיר ומפורט של מאפיינים מבניים של הלב ממערכת מודל גנטי חזק צייתן.
Protocol
Discussion
כאן אנו מציגים פרוטוקול שימושי עבור הכנת מכתים את כלי melanogaster תסיסנית הגב ורקמות הקשורים עבור דימות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי או confocal. אנו מספקים דיווח תמציתי על הפעולות מעודן על ידי והעסיק נפוץ מכתים יעיל המאפשר היטב נפתרה הדמיה באתרו של הזחל והמ?…
Acknowledgements
המחברים מודים SI ברנשטיין (סן דייגו סטייט) לקריאה ביקורתית הצעות מועילות לגבי הכנת כתב היד הזה. עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענקים SI ברנשטיין, SDSU, וכן ר בודמר, BIMR, ועל ידי אחווה פוסט דוקטורט מ שותפים המערבי הברית של איגוד הלב האמריקני אל G. Vogler ו א Cammarato.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Ethylene glycol-bis (2-amino-ethylether) -N,N,N’,N’-tetra-acetic acid (EGTA) | Reagent | Sigma-Aldrich® | E4378 | |
| Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure | Reagent | Polysciences Inc. | 50-00-0 | |
| Triton-X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich® | 9002-93-1 | |
| Alexa Fluor® 594 phalloidin | Reagent | Invitrogen™ | A12381 | |
| Vectashield® Mounting Medium for Fluorescence with DAPI | Reagent | Vector Laboratories, Inc. | H-1200 | |
| Tungsten pins | Reagent | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Pin holder | Reagent | Fine Science Tools | 26018-17 |
Referências
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. J Vis Exp. , (2009).
- Molina, M. R., Cripps, R. M. Ostia, the inflow tracts of the Drosophila heart, develop from a genetically distinct subset of cardial cells. Mech Dev. 1, 51-59 (2001).
- Dulcis, D., Levine, R. B. Glutamatergic innervation of the heart initiates retrograde contractions in adult Drosophila melanogaster. J Neurosci. 2, 271-280 (2005).
- Zeitouni, B. Signalling pathways involved in adult heart formation revealed by gene expression profiling in Drosophila. PLoS Genet. 10, 1907-1921 (2007).
- Robertson, C. W. The metamorphosis of Drosophila melanogaster, including an accurately timed account of the principal morphological change. J. Morphol. 2, 351-399 (1936).
- Miller, A. . The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. , (1950).
- Rizki, T. M. The circulatory system and associated cells and tissues. , (1978).
- Cammarato, A. Myosin transducer mutations differentially affect motor function, myofibril structure, and the performance of skeletal and cardiac muscles. Mol Biol Cell. 2, 553-562 (2008).
- Taghli-Lamallem, O. Dystrophin deficiency in Drosophila reduces lifespan and causes a dilated cardiomyopathy phenotype. Aging Cell. 2, 237-249 (2008).
- Kelso, R. J. a database documenting a GFP protein-trap insertion screen in Drosophila melanogaster. Nucleic Acids Res. 32, D418-D420 (2004).
- Dietzl, G. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 7150, 151-156 (2007).
- Mery, A. The Drosophila muscle LIM protein, Mlp84B, is essential for cardiac function. J Exp Biol. 211, 15-23 (2008).
