Aqui nós descrevemos um protocolo básico para a rotulagem fluorescentes de diferentes elementos de tubos de coração de larva e adulto Drosophila melanogaster. Estas amostras são bem adaptados para geração de imagens através de microscopia fluorescente ou confocal. Essa técnica permite a análise estrutural detalhada das características dos corações de um organismo modelo poderoso.
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Artigo de método
Labeling fluorescentes de Drosophila Estruturas Coração
Neste artigo
Resumo
Protocolo
Antes de começar a
- Prepare as seguintes soluções:
- buffer de relaxamento (artificial Drosophila hemolinfa (ADH) (ver "Visualizando o coração batendo em Drosophila") que contém 10 mM EGTA)
- fixador (formaldeído 4% em PBS 1x)
- PBSTx (PBS contendo 0,1% Triton-X-100)
- Apropriadamente diluída primário e espécie-específicos fluorescente etiquetado anticorpos secundários em PBSTx
- Dissecar Drosophila para expor os tubos cardíacos (de moscas e / ou larvas), após
- o semi-intactas Drosophila protocolo de preparação do coraç....
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Discussão
Aqui apresentamos um protocolo útil para preparar e coloração da Drosophila melanogaster vaso dorsal e dos tecidos adjacentes para geração de imagens através de microscopia fluorescente ou confocal. Nós fornecemos um relato conciso dos passos refinado por e comumente empregado em nosso laboratório para a coloração eficaz que permite a bem-resolvido em imagens in situ de larvas e tubos coração adulto Drosophila. Outros descreveram métodos similares de forma abreviada 2, 3, 4.
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Agradecimentos
Os autores agradecem SI Bernstein (San Diego State University) para a leitura crítica e sugestões úteis sobre a preparação deste manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo NIH concede a SI Bernstein, SDSU, e de R. Bodmer, BIMR, e por uma bolsa de pós-doutorado da filial dos Estados do Oeste da Associação Americana do Coração para G. Vogler e A. Cammarato.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários | |
|---|---|---|---|---|
| Ácido etilenoglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N’,N’-tetraacético (EGTA) | Reagente | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Formaldeído, 10%, livre de metanol, Ultra Puro | Reagente | Polysciences, Inc. | 50-00-0 | |
| Triton-X-100 | Reagente | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| Alexa Fluor® 594 faloidina | Reagente | Invitrogen | A12381 | |
| Meio de Montagem Vectashield® para Fluorescência com DAPI | Reagente | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Pinos de tungstênio | Reagente | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Suporte para pinos | Reagente | Fine Science Tools | 26018-17 |
Referências
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. J Vis Exp. , (2009).
- Molina, M. R., Cripps, R. M. Ostia, the inflow tracts of the Drosophila heart, develop from a genetically distinct subset of cardial cells. Mech Dev. 1, 51-59 (2001).
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Reimpressões e permissões
