תרבות ותחזוקה של בתאי גזע עובריים אנושיים

Summary

פרוטוקול זה מדגים כיצד לשמור על בריאות, מובחן האדם גזע עובריים (ES) התאים.

Abstract

האדם גזע עובריים (הס) התאים חייבים להיות במעקב ומטופל על מנת לשמור על בריאות, תרבויות מובחן. לכל הפחות, תרבויות חייב להיות מוזן בכל יום על ידי ביצוע שינוי בינוני להשלים לחדש מזינים אבוד לשמור על תרבויות ללא בידול גורמים לא רצויים. למרות כמות קטנה של בידול הוא נורמלי וצפוי בתרביות תאים גזע, תרבות יש לנקות באופן שגרתי על ידי הסרת ידני, או "לקטוף" אזורים מובחנים. זיהוי והסרה של בידול עודף מתרבויות הס תא טכניקות חיוני בשמירה על אוכלוסיה בריאה של תאים.

Protocol

1. תחזוקה: תרבויות התבוננות במיקרוסקופ הסר את צלחת אחת של תאים הס מ 37 ° C החממה ומביאים המיקרוסקופ. שימו לב המושבות בהספק נמוך, באמצעות הגדלה 2X או 5X, כדי להעריך את איכות התרבות הכללית. הערה הבאות: צבע בינוני רגיל, העדר זיהום, גלויה, גודל המושבה הכוללת, איכות וצפיפות, וכל תצפיות אחרות. שימו לב שינויי צבע בינוני. עקב שינוי ב-pH ואת דלדול של חומרים מזינים במדיום לאחר הדגירה לילה עם תאים הס, המדיום ישתנה מ גוון אדום צבע "קש". אם המדיום מופיע סגול, שינוי pH בסיסי התרחשה. אם המדיום נראה צהוב מאוד, בינוני יש acidified. צהוב בינוני מאוד יכול להיות תוצאה של מושבות צפופות מאוד טוב או זיהום. המדיום אמור להופיע ברור בכל עת. למרות רמה מסוימת של פסולת תא המדיום הוא נורמלי, זה לא אמור להופיע מעונן. אם רמה גבוהה של פסולת התא הוא ציין, התרבות אינו בריא ועלול להיות מזוהם. אם תרבויות אינן דורשות תחזוקה או passaging, הם יכולים להיות נלקח ארון הבטיחות הביולוגית להיות מוזן (ראה סעיף 2). אם התרבויות להכיל יותר מ כ -10% המבדילים מושבות, התאים יש "לנקות" באופן ידני על ידי הסרת אזורים מובחנים (ראה סעיף 3). אם תרבויות מכילות מושבות גדולות או צפוף, או את השכבה מזין MEF הוא יותר מ 12 ימים, התאים צריכים להיות passaged (ראה סעיף 4). 2. האכלה הס תאים בארון בטיחות סטרילי ביולוגי, להסיר את המכסה של המנה תרבות לשאוב את המדיום בילו. אין לאפשר את קצה פיפטה לגעת באף חלק של צלחת אחר מאשר ישירות בתוך הבארות. אם יש חשש של זיהום, שינוי פיפטה חדשה, סטרילית. שימוש pipet זכוכית סטרילית, להוסיף את הכמות המתאימה של תרבות חימם בינוני הס התא היטב כל אחד. עבור תרבויות בצלחת 6-היטב, מוסיפים 2.5 מ"ל לכל מדיום היטב. מחזירים את הצלחת אל האינקובטור להישאר 37 ° C ו 5% CO 2. 3. הסרת דיפרנציאציה בין תרבויות הס Cell המרה 9 אינץ' זכוכית פסטר pipettes לכלי לקטוף ידי עטרה טיפים על אש מבוקרת של אלכוהול צורב. וודאו כי קצה פיפטה אטום על מנת למנוע זיהום מעוגלות להימנע מגרד את הפלסטיק של המנה תרבות. לעקר את הכלים קטיף לפני השימוש באמצעות מקור אור UV בממשלה בטיחות ביולוגית או לקטוף המתחם. הסר את אזורים מובחנים. בידול מתרחשת לעתים קרובות רק בחלק של המושבה תא הס, בדרך כלל בשוליים או כתמים בודדים במרכז. אם רק קטע של מושבה הוא מבדל, רק באזור מובחן צריך להסירו. בידול יכול לעיתים קרובות להרים את צלחת גיליון "דביקות", וזה מועיל קודם להפריד את התאים מובחן משאר המושבה על ידי ציור קו באמצעות המושבה עם סוף הכלי קטיף. לאחר חתיכות של המושבה מופרדים, להחליק בעדינות את הכלי לקטוף לאורך הצלחת לנתק את תאים לא רצויים. יש להיזהר שלא לגרד יותר מדי שכבת מזין MEF בין המושבות בתהליך זה. כאשר כל התאים הבדיל יוסרו מן הצלחת (וגם צף בינוני), להחזיר את התרבות לממשלה בטיחות ביולוגית. לשאוב את המדיום המכיל תאים מבודל להחליף עם תרבות טרי בינוני הס התא. 4. Passaging הס תאים אנזימים דגירה בארון בטיחות סטרילי ביולוגי, להסיר את המכסה של צלחת 6-היטב את התרבות לשאוב את המדיום בילה מבארות להיות passaged. אין לאפשר את קצה פיפטה לגעת באף חלק של צלחת אחר מאשר ישירות בתוך הבארות. שימוש pipet זכוכית סטרילית, מוסיפים 1 מ"ל של חימם collagenase IV זה טוב להיות passaged. מחזירים את הצלחת עד 37 ° C החממה במשך 5 דקות. אוספות ואיגום תאים הס לאחר דוגרים התאים עם collagenase, לקיים את המושבות תחת המיקרוסקופ. האנזים צריך לגרום לשינוי עדין אך נצפות את הקצוות המושבה. בארון בטיחות ביולוגית, לשאוב בעדינות את האנזים מבאר כל ולהחליף 2.0 בינוני מ"ל הס תרבית תאים. עצה את הצלחת תרבות מעט כלפי לך לקחת את המדיום mL 2.0 היטב הראשונה עם pipet זכוכית 5 מ"ל. החזקת בניצב pipet לחלק התחתון של הצלחת, להחליק בעדינות את קצה pipet ברחבי היטב תוך לאט משחררים את המדיום. חזור על גירוד pipetting תנועה 3-4 פעמים עד שכל המושבות הוסרו מן הבאר. Pipet בעדינות כדי למנוע פירוק המושבות לתוך חתיכות קטנות מדי. כאשר התאים הוסרו מן הבאר הראשונה, לעזוב את תוכנו של טוב להתחיל מגרדים תאים מעל הבא היטב. כאשר כל בארות להיות passaged כבר מגורד, הבריכה בינוני המכיל את חלקי המושבה מבאר כל שפופרת 15 מ"ל סטרילי חרוטי. יש לשטוף את הבארות מגורד על ידי הוספת 1 מ"ל של מדיום תרבות הס התא היטב כל אחד. איסוף זה לשטוף להעביר צינור חרוטי. Pipet התאים בעדינות בצינור כדי לשבור את השברים מושבת עד לגודל הרצוי. צנטריפוגה את התאים למשך 5 דקות בשעה 200 x ז ציפוי תאים תאים הס בעוד תאים הס הם בצנטריפוגה, להכין צלחת חדש 6-MEF גם מזין. לייבל את הצלחת עם המידע המתאים הס התא: שורת תאים, מספר קטע חדש, תאריך המעבר. לשאוב את המדיום MEF מבארות ומוסיפים 1.0 מ"ל PBS היטב כל אחד. בעדינות מערבולת החיץ סביב בארות לשאוב לשטוף PBS. הוסף 1.5 מ"ל הס תרבות בינוני התא היטב כל להגדיר את הצלחת בצד. כאשר תאים הס שתסיים centrifuging, להביא את הצינור בחזרה לארון בטיחות ביולוגית. לשאוב supernatant, נזהר לא להפריע רופף וגדוש תא גלולה. Resuspend התאים את הכדור עם מדיום מספיק בינוני 1 מ"ל הס תא תרבות לכל גם להיות מצופה. כאשר פיצול 6 בארות חדשות, resuspend גלולה בינוני 6 מ"ל. בעדינות ובאופן שווה להוסיף 1 מ"ל של ההשעיה תא אחד מוכן היטב הצלחת מזין MEF. מניחים את הצלחת לתוך 37 ° C חממה בזהירות את הצלחת להחליק קדימה אחורה, מצד לצד כדי לפזר באופן שווה את התאים לאורך הבאר. אפשר התאים לצרף בשעה 37 ° C במשך הלילה. 5. נציג תוצאות: מובחן תאים הס הם קטנים, ארוז היטב, ובדרך כלל כוללים התפשטות גדול יותר, יותר מחוץ לתאים. בידול יכול להתרחש בתוך מושבה (איור 1A) או בין מושבות (איור 3B). Morhopologies שונים ניתן לראות בהגדלה נמוכה מתחת למיקרוסקופ. מורפולוגיה תא טוב, כפי שניתן לראות בתרשים 2A, מכיל קטן, תאים צפופים הצומחים בשכבה. תאים צריך להיות נקי, קצוות מוגדרים, עם מעט בידול לא. התאים שמוצג באיור 2B מוכנים passaging, והתאים שמוצג באיור 2C הם צפופים. באיור 1. בידול בתרבויות הס. (א) הבחנה של מושבה (ב) הבחנה בין המושבות. איור 2. מורפולוגיות לראות תרבויות הס. (א) מורפולוגיה תא טובה (ב) תאים הס כי הם מוכנים passaging (ג) בתאים צפופים.

Discussion

עקרות חייבת להישמר בכל עת כאשר עובדים עם תאים הס. נקו לעקר את ארון הבטיחות הביולוגית וכל הציוד לפני השימוש. ריאגנטים כל חייב להיות מסונן באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר גודל הנקבוביות לפני השימוש. השימוש antiboiotics התרבות תאים הס אין צורך יש להימנע.

סביבה נפרדת יש להגדיר כתחנת איסוף ייעודיים. מתחם סטרילי לתחנת יכול להיות המתחם סטטי (כגון תחנת עבודה PCR) עם מקור אור UV, ברדס זרימה למינרית, או ארון בטיחות ביולוגית. מיקרוסקופ לנתח בתוך תחנת קטיף יש צורך לבחון את מושבות כמו אזורים מובחנים יוסרו. הזכוכית בלוח הקדמי של המתחם סטטי או ארון בטיחות ביולוגית חייבת להיות שונה, כדי לאפשר oculars של המיקרוסקופ להאריך דרך לוח בלי להתפשר על זרימת האוויר עקרות נכונה.

כדי לשמור על בריאות תרבויות הס תאים, התאים חייבים להיות passaged בזמן האופטימלי, בדרך כלל כל 4-7 ימים. בשלב זה המושבות הגיעו הגודל המרבי שלהם עשוי להיות תחילת למזג. מושבות שמוזגו יכול להגביר את קצב בידול בתרבות. יחס פיצול בדרך כלל בסתיו 1:03-01:05, תלוי במספר מושבות מצופה, קצב התפשטות, והתנאים תרבות. מושבות Overplated (יחס הפיצול נמוך מדי) צפויה להתמזג בטרם עת צריך להיות passaged לפני שהם מגיעים לגודל המקסימלי שלהם.

תרבויות על שכבת מזין MEF כי הוא יותר מ 2 שבועות חייב להיות passaged על חדש MEFs כי יתמכו בצמיחה התפשטות מובחן.

מאז בידול באופן טבעי מתרחש בתרבויות הס סלולריים, כמות קטנה צפוי. בידול תכופה או מופרזת עלולה להתרחש אם תרבויות אינם מקבלים טיפול הולם. התאים חייב להיות מוזן כל יום, בין יתר הקטעים יש להימנע. השתמש תמיד ריאגנטים טריים. כל כלי התקשורת MEFs ו ריאגנטים יש להשתמש תוך 14 יום, כדי למנוע צמיחה מובחן הס התא. הרבה חדש של חומרים כימיים, כגון החלפת נוק סרום, FBS ו MEFs, צריכים להיבדק לפני השימוש. זכרו כי כל התאים הבדיל לא הוסרו לפני passaging יועברו תרבויות חדשות. כמו כן, מנסה לשמור על התאים ב 37 ° C אפשרי בכל עת. מזער את זמן התאים לבלות מחוץ החממה (למשל על הבמה מיקרוסקופ או בארון בטיחות ביולוגית.) שלב מיקרוסקופ מחומם יכול להיות מועיל מאוד אם התאים יהיו בחממה במשך פרקי זמן ארוכים.

כאשר התבוננות בתרביות תאים הס מתחת למיקרוסקופ, תחילה להעריך את איכות הגודל הכולל של המושבות להציג באמצעות כוח אובייקטיבי נמוך (2x או 5x). אם התאים הבדיל פוטנציאלי הם נצפו על צריכת חשמל נמוכה, לאשר את המורפולוגיה מובחן באמצעות המטרה הגדלה גבוהה (10X).

מיד לאחר הוצאת הבידול, את הקצוות של מושבות עשוי להופיע משוננת או פגום. דגירה למושבות לילה בינוני טרי לאפשר תאים שלא עברו התמיינות הנותרים להתאושש. ללא השפעת הבידול בתרבות, אלו מושבות הנותרים ימשיכו להתרבות כרגיל.

במידת האפשר, להתחיל ניסויים באמצעות מעבר נמוך תאים הס. קריוטיפ התאים לפני ואחרי כל הניסויים העיקריים.

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
D-MEM		Invitrogen	11965-092	For MEF medium
Fetal Bovine Serum (FBS), Certified		Invitrogen	16000-044	Heat-inactivated For MEF medium
D-MEM/F-12		Invitrogen	11330-057
Knockout™ Serum Replacement		Invitrogen	10828-028	Pre-screen to ensure support of hES cells
bFGF		Stemgent	03-0002	Use at [4 ng/mL] final
Non-essential Amino Acids		Invitrogen	11140-050
L-glutamine		Invitrogen	25030-081	200 mM (100X) Use at [1X] final
PBS		Invitrogen	14190-250	Without Ca2+ or Mg2+
Collagenase IV		Invitrogen	17104-019	Make a fresh solution at 1 mg/mL in D-MEM/F-12
Gelatin		Sigma	G1890	Type A, Porcine
Fetal Bovine Serum (FBS), Defined		HyClone	SH300.70.01	For freezing medium
6-well plates		Nunc	140675	For general culture
4-well plates		Nunc	176740	For thawing
5 mL glass pipets		Fisher	13-678-27E	Individually wrapped
15 mL conical tubes		Corning	430052	Polypropylene
Pasteur pipettes		Fisher	13-678-20D	9” glass