Schnell und feinfühlig Kolloidale Coomassie G-250 Färbung für Proteine in Polyacrylamidgelen
Summary
Dieses Video ist eine kolloidale Coomassie G-250 Färbung Protokoll nach Kang popularisieren<em> Et al.</em> Für den Nachweis von durchschnittlich 4 ng Protein in Gelen. Die Färbung ist innerhalb von 2 Stunden und ohne jegliche Anstrengung abgeschlossen. Wir verwenden routinemäßig Kang-Protokoll für analytische Zwecke in Gel-Basis Proteomik.
Abstract
Coomassie Brilliant Blue (CBB) ist ein Farbstoff der Regel für die Visualisierung von Proteinen durch SDS-PAGE getrennt verwendet, bietet eine einfache Färbung und hohe Quantifizierung. Darüber hinaus ist es vollständig kompatibel mit massenspektrometrischen Identifizierung von Proteinen. Doch trotz dieser Vorteile ist CBB angesehen werden weniger empfindlich als Silber-oder Fluoreszenz-Färbungen und daher nur selten zum Nachweis von Proteinen in der analytischen Gel-Basis Proteomik Ansätze verwendet.
Mehrere Verbesserungen der ursprünglichen Coomassie-Protokoll 1 wurden unternommen, um die Empfindlichkeit der CBB zu erhöhen. Zwei wichtige Änderungen eingeführt wurden, um den Nachweis von low-reiche Proteine, die durch Umwandlung der Farbstoffmoleküle in kolloidalen Teilchen zu verbessern: Im Jahr 1988 angewendet Neuhoff und Kollegen 20% Methanol und höhere Konzentrationen von Ammoniumsulfat in die CBB G-250 basiert Färbelösung 2, und im Jahr 2004 Candiano et al. etablierten Blue Silver mit CBB G-250 mit Phosphorsäure in Gegenwart von Ammoniumsulfat und Methanol 3. Dennoch, all diese Modifikationen nur erlauben eine Detektion von etwa 10 ng Protein. Ein weit fameless Protokoll für kolloidale Coomassie-Färbung wurde von Kang et al. Im Jahr 2002, wo sie Neuhoff ist kolloidales CBB Färbeprotokoll geändert in Bezug auf die komplexierenden Substanzen. Anstelle von Ammoniumsulfat sie verwendet Aluminiumsulfat und Methanol wurde durch das weniger toxische Ethanol 4 ersetzt. Der Roman Aluminium-Färbung in Kang-Studie zeigte eine überlegene Empfindlichkeit, die so niedrig wie 1 ng / Band (Phosphorylase b) mit wenig Sensibilität Variation in Abhängigkeit von Proteinen entdeckt.
Hier zeigen wir Anwendung von Kang-Protokoll zur schnellen und sensitiven kolloidale Coomassie-Färbung von Proteinen in analytischen Zwecken. Wir zeigen die schnelle und einfache Protokoll mit zweidimensionalen Gels routinemäßig in unserer Arbeitsgruppe durchgeführt.
Protocol
Discussion
Innovative oder nur ein weiterer Coomassie-Protokoll?
Im Moment gibt es mehrere Protokolle für Färbeverfahren mit Coomassie Brilliant Blue. Die meisten von ihnen aus kleineren oder größeren Modifikationen eines der am häufigsten verwendeten Protokolle, die von Neuhoff und seine Kollegen haben 2 Ergebnisse. Auch Kang-Protokoll auf Neuhoff-Formel basieren. Aber ist es wirklich eine Alternative Coomassie-Färbung für Proteomforschung? Wir werden Bild zwei Hauptthemen, Nachweisg…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Nicola Wiethölter für die Vorbereitung und Färbung der 1-D Gelen.
Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der Deutschen Forschungsgemeinschaft (GRK 1089/project 5 bis ND und SM) gefördert und unterstützt durch ein Forschungsstipendium der Jürgen Manchot Stiftung zu ND.
Materials
| Name of product | Company | Catalogue No. | Comments |
| For IEF and SDS-PAGE: | |||
| Immobiline DryStrip gels | GE Healthcare | 17-6001-94 | Can even be used 2 years after expire date. |
| Immobiline DryStrip Reswelling Tray | GE Healthcare | 80-6371-84 | Do not clean with organic solvents. Designed for 7-18 cm IPG-strips. |
| Immobiline DryStrip Kit | GE Healthcare | 18-1004-30 | Includes a tray, electrode holder, anode and cathode electrodes, aligner and sample cup bar and sample cups. |
| EPS 3501 XL Power Supply | GE Healthcare | 18-1130-05 | Supplies voltage up to 3500 V. |
| Multiphor II Electrophoresis Unit | GE Healthcare | 18-1018-06 | Movable electrodes enable IEF in IPG strips of all length (7-24 cm IPG strips) |
| PerfectBlue gel system Twin S | Peqlab | 45-1010-C | SDS-PAGE in 10×10 cm mini-gel format. Gel chamber includes a cooling system. |
| For colloidal Coomassie G-250 staining: | |||
| staining dishes with lids | VWR | 216-3412 | Fits for mini-gels. Stackable on shaker. |
| aluminium sulfate-18-hydrate | Merck | 1.01102.5000 | We made best experience with Merck. Just available in 5 kg package. |
| orthophosphoric acid | Prolabo | 20 624.295 | Sold in glass bottles. |
Referências
- Fazekas de St Groth, S., Webster, S. R. G., Datyner, A. Two new staining procedures for quantitative estimation of proteins on electrophoretic strips. Biochim. Biophys. Acta. 71, 377-391 (1963).
- Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250. Electrophoresis. 9, 255-262 (1988).
- Candiano, G., Bruschi, M., Musante, L., Santucci, L., Ghiggeri, G. M., Carnemolla, B., Orecchia, P., Zardi, L., Rigetti, P. G. Blue Silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25, 1327-1333 (2004).
- Kang, D., Gho, S. G., Suh, M., Kang, C. Highly Sensitive and Fast Protein Detection with Coomassie Brilliant Blue in Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis. Bull. Korean Chem. Soc. 11, 1511-1512 (2002).
- Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal. Chem. 68, 850-858 (1996).
