फास्ट और संवेदनशील कोलाइडयन polyacrylamide जैल में Coomassie जी 250-प्रोटीन के लिए धुंधला
Summary
इस वीडियो कांग के लिए अनुसार एक कोलाइडयन Coomassie जी 250 धुंधला प्रोटोकॉल लोकप्रिय जाएगा<em> एट अल.</em> औसत 4 जैल में एनजी प्रोटीन का पता लगाने के के लिए. धुंधला 2 घंटे के भीतर और किसी भी प्रयास के बिना पूरा हो गया है. हम नियमित रूप से विश्लेषणात्मक प्रयोजनों के लिए जेल आधारित प्रोटिओमिक्स में कांग प्रोटोकॉल का उपयोग करें.
Abstract
Coomassie खूब ब्लू (CBB) सामान्यतः एसडीएस PAGE द्वारा अलग प्रोटीन के दृश्य के लिए प्रयोग किया जाता है, एक साधारण धुंधला प्रक्रिया और उच्च quantitation की पेशकश डाई है. इसके अलावा, यह पूरी तरह से बड़े पैमाने पर spectrometric प्रोटीन की पहचान के साथ संगत है. लेकिन इन फायदों के बावजूद, CBB चांदी या प्रतिदीप्ति stainings की तुलना में कम संवेदनशील है और इसलिए शायद ही कभी विश्लेषणात्मक जेल आधारित प्रोटिओमिक दृष्टिकोण में प्रोटीन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया हो माना जाता है.
CBB की संवेदनशीलता को बढ़ाने के मूल Coomassie प्रोटोकॉल 1 के कई सुधार किया गया है. दो प्रमुख संशोधनों के लिए कोलाइडयन कण में डाई अणु कनवर्ट करके कम प्रचुर मात्रा में प्रोटीन का पता लगाने के बढ़ाने शुरू किए गए थे: 1988 में, Neuhoff और उनके सहयोगियों ने CBB जी 250 आधारित धुंधला 2 समाधान में लागू 20% मेथनॉल और अमोनियम सल्फेट के उच्च सांद्रता, और 2004 Candiano एट अल में. ब्लू रजत फॉस्फोरिक एसिड के साथ अमोनियम सल्फेट और मेथनॉल 3 की उपस्थिति में CBB जी 250 का उपयोग कर स्थापित किया गया था. फिर भी, इन सभी संशोधनों बस लगभग 10 एनजी प्रोटीन का पता लगाने की अनुमति है. कोलाइडयन Coomassie धुंधला के लिए एक व्यापक रूप से fameless प्रोटोकॉल कांग एट अल द्वारा 2002 में प्रकाशित किया गया था जहां वे complexing पदार्थों के बारे में Neuhoff कोलाइडयन CBB धुंधला प्रोटोकॉल संशोधित. अमोनियम सल्फेट के बजाय वे एल्यूमीनियम सल्फेट और मेथनॉल कम विषाक्त इथेनॉल 4 द्वारा प्रतिस्थापित किया गया था इस्तेमाल किया. कांग अध्ययन में उपन्यास एल्यूमीनियम आधारित धुंधला हो जाना बेहतर संवेदनशीलता के रूप में 1 एनजी / थोड़ा संवेदनशीलता भिन्नता प्रोटीन के आधार पर के साथ बैंड (phosphorylase ख) के रूप में कम का पता लगाता है दिखाया.
यहाँ, हम विश्लेषणात्मक प्रयोजनों में प्रोटीन की तेज और संवेदनशील कोलाइडयन Coomassie धुंधला के लिए कांग प्रोटोकॉल के आवेदन प्रदर्शित करता है. हम जल्दी और आसानी से दो आयामी जैल नियमित रूप से हमारे समूह में काम कर प्रदर्शन का उपयोग प्रोटोकॉल उदाहरण देकर स्पष्ट करना होगा.
Protocol
Discussion
अभिनव या सिर्फ एक और Coomassie प्रोटोकॉल?
फिलहाल Coomassie खूब ब्लू के साथ प्रक्रियाओं को धुंधला करने के लिए एकाधिक प्रोटोकॉल मौजूद हैं. उनमें से ज्यादातर Neuhoff और दो सहयोगियों द्वारा सबसे अधिक इस्?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम तैयारी और 1-D जैल के धुंधला हो जाना करने के लिए डा. निकॉला Wiethölter धन्यवाद.
इस काम ड्यूश Forschungsgemeinschaft (GRK एनडी और एस.एम. 5 1089/project) से एक अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था और Jürgen Manchot से एक शोध फैलोशिप एन डी के लिए Stiftung द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name of product | Company | Catalogue No. | Comments |
| For IEF and SDS-PAGE: | |||
| Immobiline DryStrip gels | GE Healthcare | 17-6001-94 | Can even be used 2 years after expire date. |
| Immobiline DryStrip Reswelling Tray | GE Healthcare | 80-6371-84 | Do not clean with organic solvents. Designed for 7-18 cm IPG-strips. |
| Immobiline DryStrip Kit | GE Healthcare | 18-1004-30 | Includes a tray, electrode holder, anode and cathode electrodes, aligner and sample cup bar and sample cups. |
| EPS 3501 XL Power Supply | GE Healthcare | 18-1130-05 | Supplies voltage up to 3500 V. |
| Multiphor II Electrophoresis Unit | GE Healthcare | 18-1018-06 | Movable electrodes enable IEF in IPG strips of all length (7-24 cm IPG strips) |
| PerfectBlue gel system Twin S | Peqlab | 45-1010-C | SDS-PAGE in 10×10 cm mini-gel format. Gel chamber includes a cooling system. |
| For colloidal Coomassie G-250 staining: | |||
| staining dishes with lids | VWR | 216-3412 | Fits for mini-gels. Stackable on shaker. |
| aluminium sulfate-18-hydrate | Merck | 1.01102.5000 | We made best experience with Merck. Just available in 5 kg package. |
| orthophosphoric acid | Prolabo | 20 624.295 | Sold in glass bottles. |
Referências
- Fazekas de St Groth, S., Webster, S. R. G., Datyner, A. Two new staining procedures for quantitative estimation of proteins on electrophoretic strips. Biochim. Biophys. Acta. 71, 377-391 (1963).
- Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250. Electrophoresis. 9, 255-262 (1988).
- Candiano, G., Bruschi, M., Musante, L., Santucci, L., Ghiggeri, G. M., Carnemolla, B., Orecchia, P., Zardi, L., Rigetti, P. G. Blue Silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25, 1327-1333 (2004).
- Kang, D., Gho, S. G., Suh, M., Kang, C. Highly Sensitive and Fast Protein Detection with Coomassie Brilliant Blue in Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis. Bull. Korean Chem. Soc. 11, 1511-1512 (2002).
- Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal. Chem. 68, 850-858 (1996).
