Rápido y sensible coloidal Coomassie G-250 La tinción de proteínas en geles de poliacrilamida
Summary
Este vídeo se popularizar un Coomassie coloidal G-250 protocolo de tinción de acuerdo con Kang<em> Et al.</em> Para la detección de la proteína promedio de 4 ng en geles. La tinción se completa en 2 horas y sin ningún esfuerzo. Nosotros usamos el protocolo de Kang para fines de análisis en gel a base de la proteómica.
Abstract
Coomassie Brilliant Blue (CBB) es un colorante utilizado para la visualización de proteínas separadas por SDS-PAGE, que ofrece un procedimiento de tinción simple y cuantificación de alta. Además, es totalmente compatible con la identificación de proteínas por espectrometría de masas. Pero a pesar de estas ventajas, el BCB se mira para ser menos sensible que la plata y coloraciones de fluorescencia y por lo tanto, rara vez se utiliza para la detección de proteínas en analíticas proteómicas a base de gel.
Mejoras en varios de los originales una Coomassie protocolo se han hecho para aumentar la sensibilidad de la broca. Dos importantes modificaciones fueron introducidas para mejorar la detección de proteínas poco abundantes mediante la conversión de las moléculas de colorante en las partículas coloidales: En 1988, Neuhoff y sus colegas aplicaron 20% de metanol y una mayor concentración de sulfato de amonio en el CBB G-250 basado en solución de tinción 2, y en 2004 al Candiano et. establecido con Blue Silver CBB G-250 con ácido fosfórico en la presencia de sulfato de amonio y metanol 3. Sin embargo, todas estas modificaciones sólo permiten una detección de la proteína de aproximadamente 10 ng. Un protocolo muy fameless para la tinción de Coomassie coloidal fue publicado por Kang et al. En 2002 en el que modificaron coloidal Neuhoff el protocolo de tinción con respecto a la CBB complejantes. En lugar de sulfato de amonio se utiliza sulfato de aluminio y el metanol fue sustituido por el 4 de etanol menos tóxicos. La base de aluminio nuevas manchas en el estudio de Kang mostró mayor sensibilidad que detecta tan bajo como 1 ng / banda (fosforilasa b) con una variación poco de sensibilidad en función de las proteínas.
En este sentido, demostrar la aplicación del protocolo de Kang para la tinción coloidal rápida y sensible de Coomassie de proteínas en la realización de análisis. Vamos a ilustrar el protocolo rápida y sencilla con dos dimensiones geles realizada de forma rutinaria en nuestro grupo de trabajo.
Protocol
Discussion
Innovadora o simplemente un protocolo de Coomassie?
Por el momento existen varios protocolos para los procedimientos de tinción con Coomassie Brilliant Blue. La mayoría de ellos consecuencia de las modificaciones de menor o mayor de uno de los protocolos más utilizados por Neuhoff y colegas 2. También protocolo Kang está basado en la fórmula de Neuhoff. Pero en realidad es un método alternativo de Coomassie tinción para la investigación proteómica? Vamos a imagen dos cue…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Dr. Nicola Wiethölter para la preparación y tinción de 1-D geles.
Este trabajo fue financiado por una beca de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (GRK 1089/project 5 a ND y SM) y apoyado por una beca de investigación de la Fundación para Manchot Jürgen Key.
Materials
| Name of product | Company | Catalogue No. | Comments |
| For IEF and SDS-PAGE: | |||
| Immobiline DryStrip gels | GE Healthcare | 17-6001-94 | Can even be used 2 years after expire date. |
| Immobiline DryStrip Reswelling Tray | GE Healthcare | 80-6371-84 | Do not clean with organic solvents. Designed for 7-18 cm IPG-strips. |
| Immobiline DryStrip Kit | GE Healthcare | 18-1004-30 | Includes a tray, electrode holder, anode and cathode electrodes, aligner and sample cup bar and sample cups. |
| EPS 3501 XL Power Supply | GE Healthcare | 18-1130-05 | Supplies voltage up to 3500 V. |
| Multiphor II Electrophoresis Unit | GE Healthcare | 18-1018-06 | Movable electrodes enable IEF in IPG strips of all length (7-24 cm IPG strips) |
| PerfectBlue gel system Twin S | Peqlab | 45-1010-C | SDS-PAGE in 10×10 cm mini-gel format. Gel chamber includes a cooling system. |
| For colloidal Coomassie G-250 staining: | |||
| staining dishes with lids | VWR | 216-3412 | Fits for mini-gels. Stackable on shaker. |
| aluminium sulfate-18-hydrate | Merck | 1.01102.5000 | We made best experience with Merck. Just available in 5 kg package. |
| orthophosphoric acid | Prolabo | 20 624.295 | Sold in glass bottles. |
Referências
- Fazekas de St Groth, S., Webster, S. R. G., Datyner, A. Two new staining procedures for quantitative estimation of proteins on electrophoretic strips. Biochim. Biophys. Acta. 71, 377-391 (1963).
- Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250. Electrophoresis. 9, 255-262 (1988).
- Candiano, G., Bruschi, M., Musante, L., Santucci, L., Ghiggeri, G. M., Carnemolla, B., Orecchia, P., Zardi, L., Rigetti, P. G. Blue Silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25, 1327-1333 (2004).
- Kang, D., Gho, S. G., Suh, M., Kang, C. Highly Sensitive and Fast Protein Detection with Coomassie Brilliant Blue in Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis. Bull. Korean Chem. Soc. 11, 1511-1512 (2002).
- Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal. Chem. 68, 850-858 (1996).
