Proteinler için Poliakrilamid Jeller Hızlı ve Hassas Kolloidal Coomassie G-250 Boyama
Summary
Bu video Kang göre kolloidal Coomassie G-250 boyama protokol sevdirmek olacaktır<em> Ve ark.</em> Jeller ortalama 4 ng protein tespiti için. Boyama ve herhangi bir çaba olmadan 2 saat içinde tamamlanır. Biz rutin analitik amaçlar için jel bazlı proteomik Kang'ın protokolü kullanın.
Abstract
Coomassie Brillant Blue (CBB), genellikle basit bir boyama prosedürü ve yüksek kantitatif sunan SDS-PAGE ile ayrılmış proteinlerin görselleştirme için kullanılan bir boya. Ayrıca, kitle spektrometrik protein kimlik ile tamamen uyumlu. Ancak bu avantajlara rağmen, CBB, gümüş ya da floresan renklendirmeler daha az duyarlı ve bu nedenle analitik jel tabanlı proteomik yaklaşımlar proteinlerin tespiti için kullanılan nadir olarak kabul edilir.
Orijinal Coomassie protokolü 1 CBB duyarlılığını artırmak için bazı geliştirmeler yapılmış. Kolloidal parçacıkları içine boya molekülleri dönüştürerek düşük-bol proteinlerin tespiti geliştirmek için iki önemli değişiklikler getirilmiştir: 1988 yılında, Neuhoff ve arkadaşları CBB G-250 tabanlı boyama çözüm 2,% 20 metanol ve uygulanan yüksek konsantrasyonlarda amonyum sülfat 2004 Candiano ve ark. Mavi Gümüş, fosforik asit, amonyum sülfat ve metanol 3 varlığı ile G-250 CBB kullanarak kuruldu . Bununla birlikte, tüm bu değişiklikler sadece yaklaşık 10 ng protein bir algılama sağlar. Kolloidal Coomassie boyama için yaygın fameless bir protokol Kang ve ark tarafından 2002 yılında yayımlandı. Kompleks maddeler ile ilgili Neuhoff kolloidal CBB boyama protokol değiştirilmiş. Bunun yerine amonyum sülfat, alüminyum sülfat ve metanol yerine daha az toksik etanol 4 kullandı . Roman alüminyum bazlı Kang'ın çalışmada boyama biraz hassasiyet varyasyon proteinleri bağlı olarak 1 ng / bant (fosforilaz b) gibi düşük algılar üstün hassasiyet gösterdi.
Burada, hızlı ve hassas analitik amaçlarla proteinlerin kolloidal Coomassie boyama Kang'ın protokolü uygulaması göstermektedir. Biz rutin çalışma grubunda yapılan iki boyutlu jeller kullanarak hızlı ve kolay bir protokol gösterecektir.
Protocol
Discussion
Yenilikçi ya da sadece başka bir Coomassie protokol?
Şu anda Coomassie Brillant Blue prosedürleri boyama için birden fazla protokol var. Çoğu Neuhoff ve meslektaşları 2 tarafından en yaygın olarak kullanılan protokoller küçük veya büyük değişiklikler sonucu. Ayrıca Kang'ın protokolü Neuhoff formülü dayanmaktadır. Ama gerçekten proteomik araştırma için alternatif Coomassie boyama yöntemi nedir? Biz diğer Coomassie protokolleri ve hatta gümüş ve…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Nicola Wiethölter Biz 1-D jellerin hazırlanması ve boyama için teşekkür ederiz.
Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft (ND ve SM GRK 1089/project 5) hibe tarafından finanse edilen ve ND için Stiftung Jürgen Manchot bir araştırma bursu ile desteklenmiştir.
Materials
| Name of product | Company | Catalogue No. | Comments |
| For IEF and SDS-PAGE: | |||
| Immobiline DryStrip gels | GE Healthcare | 17-6001-94 | Can even be used 2 years after expire date. |
| Immobiline DryStrip Reswelling Tray | GE Healthcare | 80-6371-84 | Do not clean with organic solvents. Designed for 7-18 cm IPG-strips. |
| Immobiline DryStrip Kit | GE Healthcare | 18-1004-30 | Includes a tray, electrode holder, anode and cathode electrodes, aligner and sample cup bar and sample cups. |
| EPS 3501 XL Power Supply | GE Healthcare | 18-1130-05 | Supplies voltage up to 3500 V. |
| Multiphor II Electrophoresis Unit | GE Healthcare | 18-1018-06 | Movable electrodes enable IEF in IPG strips of all length (7-24 cm IPG strips) |
| PerfectBlue gel system Twin S | Peqlab | 45-1010-C | SDS-PAGE in 10×10 cm mini-gel format. Gel chamber includes a cooling system. |
| For colloidal Coomassie G-250 staining: | |||
| staining dishes with lids | VWR | 216-3412 | Fits for mini-gels. Stackable on shaker. |
| aluminium sulfate-18-hydrate | Merck | 1.01102.5000 | We made best experience with Merck. Just available in 5 kg package. |
| orthophosphoric acid | Prolabo | 20 624.295 | Sold in glass bottles. |
Referências
- Fazekas de St Groth, S., Webster, S. R. G., Datyner, A. Two new staining procedures for quantitative estimation of proteins on electrophoretic strips. Biochim. Biophys. Acta. 71, 377-391 (1963).
- Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250. Electrophoresis. 9, 255-262 (1988).
- Candiano, G., Bruschi, M., Musante, L., Santucci, L., Ghiggeri, G. M., Carnemolla, B., Orecchia, P., Zardi, L., Rigetti, P. G. Blue Silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25, 1327-1333 (2004).
- Kang, D., Gho, S. G., Suh, M., Kang, C. Highly Sensitive and Fast Protein Detection with Coomassie Brilliant Blue in Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis. Bull. Korean Chem. Soc. 11, 1511-1512 (2002).
- Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal. Chem. 68, 850-858 (1996).
