العزلة والتلاعب الجيني لأمراض القلب للبالغين Myocytes التصوير متحد البؤر
Summary
myocytes القلب للبالغين هي الخلايا الأولية التي يمكن أن تكون معزولة عن قلوب الحيوانات وتربيتها لعدة أيام. ويمكن خلال هذه الفترة يمكن استخدام الثقافة الفيروسة الغدانية نقل الجينات المشفرة للتعبير عن أجهزة الاستشعار وراثيا (GEBs) أو البروتينات الانصهار الفلورسنت. كلا النهجين تسمح التحقيقات الخلوية عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر.
Abstract
مقبولة على نطاق واسع myocytes القلب المعزولة من قلوب الكبار كنموذج في مكان ما في منتصف الطريق بين الخلايا العضلية الجنينية والولدان على جانب واحد وقلب العمل من ناحية أخرى. وهكذا ، العضلية تكون بمثابة نماذج جيدة لفسيولوجيا القلب والفيزيولوجيا المرضية الخلوية ، لإجراء تحقيقات الصيدلانية وكذلك لاستكشاف النماذج الحيوانية المعدلة وراثيا. نحن هنا وصفا لطريقة عزل الخلايا من القلب. وعلاوة على ذلك أن نظهر كيف يمكن إجراء المعالجة الجينية على myocytes القلب دون تربية حيوان المعدلة وراثيا : هذا هو مزيج من الثقافة على المدى الطويل (1 أسبوع) والفيروسة الغدانية نقل الجينات. يتم وصف هذا الأخير واحد من بناء الفيروس إلى تنبيغ الخلايا. يمكن استخدامه للتعبير عن أجهزة الاستشعار المرمزة وراثيا (GEBs) ، والبروتينات الفلورية الانصهار ، ولكن أيضا للبروتين أكثر من التعبير والتنظيم لأسفل ، على سبيل المثال باستخدام رني. هنا نقدم مثالا للتعبير عن بروتين الانصهار تلطيخ بنية التحت خلوية (غولجي). يمكن لمثل بروتين تعبير يمكن تصور بواسطة التصوير مبائر من Z – كدسات لإعادة الإعمار 3D – الهياكل التحت خلوية. ويتضمن البروتوكول دولة من بين الفن في الثقافة الخلية والبيولوجيا الجزيئية والفيزياء الحيوية ، ويوفر بالتالي نهجا لاستكشاف آفاق جديدة في مجال أمراض القلب الخلوية.
Protocol
Discussion
ويمكن تكييف الإجراء الموضح لعزل الخلايا العضلية الفئران على الأنواع الأخرى ، مثل الماوس 4 ، إذا لزم الأمر. معلمة احتياجات التكيف التي هي مزيج انزيم لهضم (أنظر أدناه) ، وكذلك مدة الهضم. أن ندرك أن بعض أنواع خلايا (مثل الماوس) قد يكون أكثر هشاشة من غيرها (مثل الفئران…
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الوطنية الألمانية (DFG) والمعهد الاتحادي لتقييم المخاطر (BFR ، ألمانيا).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Anesthesia solution | Serumwerk Bernburg GmbH (Ursotamin), Bayer Health Care (Rompun) | Mixture of 1 ml Ursotamin (100 mg/ml Ketaminhydrochlorid) and 240 μl Rompun (2% Xylazinhydrochlorid) | ||
| Citrate solution | 117,64 mg sodium citrate in 10 ml 0.9% NaCl solution | |||
| Solution A | 134 mM NaCl, 4 mM KCl, 11 mM glucose, 1.2 mM MgSO4, 1.2 mM Na2HPO4, 10 mM HEPES, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered | |||
| Solution A+ | Content of solution A plus 0.2 mM EGTA, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered | |||
| Liberase solution | F. Hoffmann‐ La Roche Ltd. | 11988476 001 | 500 μl stock solution in 15 ml solution A (stock solution: 10 mg/ml Liberase Blendzyme 4 in aqua dest.) | |
| Solution B | Content of solution A plus 200 μM CaCl2 and 0.1% DNase solution | |||
| Solution B1/2 | 1:1 mixture of solution A and solution B | |||
| DNase solution | Sigma‐ Aldrich Co. | D4527 | Deoxyribonuclease I, Type 2 from bovine pancreas, 40 KU (15 mg) are dissolved in 5 ml of 10 mM Tris‐HCl buffer, adjusted to pH=7.35, additional content: 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM dithioerythritol; this solution is mixed with 5 ml glycerol | |
| Extracellular matrix protein (ECM) solution | Extracellular matrix protein (ECM) solution | E1270 | 1 ml stock solution as purchased is diluted with 6 mL medium M199 | |
| Culture medium M199 | PAA | E15‐834 | Medium M199 supplemented with 1 μl/ml ITS solution and 20 μl/ml penicillin‐streptomycin solution (5000 units/ml) | |
| ITS solution | 25 mg Insulin, 25 mg Transferrin and 50 μl Selenite stock solution are dissolved in 5 ml aqua dest. (stock solution: 0.5 mg/ml Sodiumselenite in aqua dest.). Add a few drops of 1 M HCl until one should get a clear solution. Aliquots can be frozen. | |||
| Tyrode | 135 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 2mM MgCl2, 10 mM glucose, 10 mM HEPES, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered | |||
| Master mix | 5 μl 10×PCR‐Buffer, 5 μl MgCl2 (25 mM), 2 μl forward primer, 2 μl reverse primer, 1 μl dNTP´s (10 mM each), 33 μl H2O, 1 μl DMSO, 1 μl Taq‐DNA polymerase for each sample | |||
| LB‐Medium | 10 g/l Tryptone, 5 g/l Yeast extract, 5 g/l NaCl (and 15 g/l Agar if used as solid medium), pH 7.0 | |||
| Pac I | New England Biolabs | R0547L | preparation: 50 μg DNA, 5 μl 10×buffer, 0.5 μl 100×BSA, 0.75 μl Pac I, fill with H2O up to final volume of 50μl |
Referências
- Kaestner, L., Ruppenthal, S., S, ., Licha, K., Lin, C. P. . Molecular Imaging II. Vol. 7370, 737008-737008 (2009).
- Viero, C., Kraushaar, U., Ruppenthal, S. In vivo imaging of Drosophila melanogaster pupae with mesoscopic fluorescence tomography. Cell Calcium. 43 (1), 59-59 (2008).
- Kaestner, L., Lipp, P., Shorte, S. L., Frischknecht, F. . Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 289-289 (2007).
- Kaestner, L., Lipp, P., Popp, J., von Bally, G. . Optics in Life Science. Vol. 6633, 66330K-66330K (2007).
- Rinne, A., Littwitz, C., Bender, K. Adenovirus-mediated delivery of short hairpin RNA (shRNA) mediates efficient gene silencing in terminally differentiated cardiac myocytes. Methods Mol Biol. 515, 107-107 (2009).
