Confocal इमेजिंग के लिए वयस्क कार्डिएक Myocytes के आनुवंशिक हेरफेर अलगाव
Summary
वयस्क हृदय myocytes प्राथमिक कोशिकाओं है कि जानवरों के दिल से अलग किया जा सकता है और कई दिनों के लिए सभ्य हैं. इस संस्कृति की अवधि के भीतर adenoviral जीन स्थानांतरण आनुवंशिक एन्कोडेड (GEBs) biosensors या फ्लोरोसेंट संलयन प्रोटीन को व्यक्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. दोनों दृष्टिकोण confocal माइक्रोस्कोपी के माध्यम से सेलुलर जांच की अनुमति देते हैं.
Abstract
कार्डिएक वयस्क दिल से पृथक myocytes कहीं मॉडल भ्रूण और नवजात की मांसपेशी कोशिकाओं के एक तरफ और दूसरे पर एक काम दिल के बीच आधे रास्ते के रूप में व्यापक रूप से स्वीकार किए जाते हैं. इस प्रकार, cardiomyocytes हृदय सेलुलर फिजियोलॉजी और pathophysiology के लिए अच्छा मॉडल के रूप में सेवा करते हैं, के रूप में अच्छी तरह के रूप में ट्रांसजेनिक पशु मॉडल का अन्वेषण के लिए दवा की जांच के लिए. यहाँ हम दिल से कोशिकाओं को अलग करने की एक विधि का वर्णन. इसके अलावा हम बताएंगे कि कैसे एक ट्रांसजेनिक पशु प्रजनन के बिना हृदय myocytes पर एक आनुवंशिक हेरफेर किया जा सकता है: यह दीर्घकालिक संस्कृति के संयोजन (1 सप्ताह) और adenoviral जीन स्थानांतरण. बाद एक वायरस के निर्माण से कोशिकाओं के पारगमन के लिए वर्णित है. यह आनुवंशिक एन्कोडेड (GEBs) biosensors, फ्लोरोसेंट संलयन प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन यह भी अभिव्यक्ति से अधिक प्रोटीन के लिए और विनियमन, जैसे आरएनएआई का उपयोग कर नीचे. यहाँ हम एक subcellular संरचना (Golgi) धुंधला हो जाना एक संलयन प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए एक उदाहरण प्रदान करते हैं. इस तरह के प्रोटीन अभिव्यक्ति Z-ढेर confocal इमेजिंग द्वारा कल्पना subcellular संरचनाओं के एक-3D पुनर्निर्माण के लिए किया जा सकता है. प्रोटोकॉल सेल संस्कृति, आण्विक जीव विज्ञान और बायोफिज़िक्स में राज्य के-the-कला शामिल हैं और इस तरह सेलुलर कार्डियोलॉजी में नए क्षितिज की तलाश के लिए एक दृष्टिकोण प्रदान करता है.
Protocol
Discussion
अन्य प्रजातियों, 4 माउस जैसे चूहे cardiomyocytes के अलगाव के लिए वर्णित की प्रक्रिया अनुकूलित किया जा सकता है, यदि आवश्यक हो. एक पैरामीटर है कि अनुकूलन की जरूरत है पाचन के लिए एंजाइम मिश्रण (नीचे देखें) और भी प?…
Acknowledgements
यह काम जर्मन राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (DFG) और जोखिम मूल्यांकन के लिए संघीय संस्थान (BfR, जर्मनी) द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Anesthesia solution | Serumwerk Bernburg GmbH (Ursotamin), Bayer Health Care (Rompun) | Mixture of 1 ml Ursotamin (100 mg/ml Ketaminhydrochlorid) and 240 μl Rompun (2% Xylazinhydrochlorid) | ||
| Citrate solution | 117,64 mg sodium citrate in 10 ml 0.9% NaCl solution | |||
| Solution A | 134 mM NaCl, 4 mM KCl, 11 mM glucose, 1.2 mM MgSO4, 1.2 mM Na2HPO4, 10 mM HEPES, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered | |||
| Solution A+ | Content of solution A plus 0.2 mM EGTA, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered | |||
| Liberase solution | F. Hoffmann‐ La Roche Ltd. | 11988476 001 | 500 μl stock solution in 15 ml solution A (stock solution: 10 mg/ml Liberase Blendzyme 4 in aqua dest.) | |
| Solution B | Content of solution A plus 200 μM CaCl2 and 0.1% DNase solution | |||
| Solution B1/2 | 1:1 mixture of solution A and solution B | |||
| DNase solution | Sigma‐ Aldrich Co. | D4527 | Deoxyribonuclease I, Type 2 from bovine pancreas, 40 KU (15 mg) are dissolved in 5 ml of 10 mM Tris‐HCl buffer, adjusted to pH=7.35, additional content: 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM dithioerythritol; this solution is mixed with 5 ml glycerol | |
| Extracellular matrix protein (ECM) solution | Extracellular matrix protein (ECM) solution | E1270 | 1 ml stock solution as purchased is diluted with 6 mL medium M199 | |
| Culture medium M199 | PAA | E15‐834 | Medium M199 supplemented with 1 μl/ml ITS solution and 20 μl/ml penicillin‐streptomycin solution (5000 units/ml) | |
| ITS solution | 25 mg Insulin, 25 mg Transferrin and 50 μl Selenite stock solution are dissolved in 5 ml aqua dest. (stock solution: 0.5 mg/ml Sodiumselenite in aqua dest.). Add a few drops of 1 M HCl until one should get a clear solution. Aliquots can be frozen. | |||
| Tyrode | 135 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 2mM MgCl2, 10 mM glucose, 10 mM HEPES, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered | |||
| Master mix | 5 μl 10×PCR‐Buffer, 5 μl MgCl2 (25 mM), 2 μl forward primer, 2 μl reverse primer, 1 μl dNTP´s (10 mM each), 33 μl H2O, 1 μl DMSO, 1 μl Taq‐DNA polymerase for each sample | |||
| LB‐Medium | 10 g/l Tryptone, 5 g/l Yeast extract, 5 g/l NaCl (and 15 g/l Agar if used as solid medium), pH 7.0 | |||
| Pac I | New England Biolabs | R0547L | preparation: 50 μg DNA, 5 μl 10×buffer, 0.5 μl 100×BSA, 0.75 μl Pac I, fill with H2O up to final volume of 50μl |
Referências
- Kaestner, L., Ruppenthal, S., S, ., Licha, K., Lin, C. P. . Molecular Imaging II. Vol. 7370, 737008-737008 (2009).
- Viero, C., Kraushaar, U., Ruppenthal, S. In vivo imaging of Drosophila melanogaster pupae with mesoscopic fluorescence tomography. Cell Calcium. 43 (1), 59-59 (2008).
- Kaestner, L., Lipp, P., Shorte, S. L., Frischknecht, F. . Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 289-289 (2007).
- Kaestner, L., Lipp, P., Popp, J., von Bally, G. . Optics in Life Science. Vol. 6633, 66330K-66330K (2007).
- Rinne, A., Littwitz, C., Bender, K. Adenovirus-mediated delivery of short hairpin RNA (shRNA) mediates efficient gene silencing in terminally differentiated cardiac myocytes. Methods Mol Biol. 515, 107-107 (2009).
