Isolering och genetisk manipulation av vuxen Cardiac myocyter för Confocal Imaging
Summary
Vuxen hjärt myocyter är primära celler som kan isoleras från djur hjärtan och odlade i flera dagar. Inom denna kultur period adenovirala genöverföring kan användas för att uttrycka genetiskt kodade biosensorer (GEBs) eller fluorescerande proteiner fusion. Båda metoder kan cellulära undersökningar med hjälp av konfokalmikroskopi.
Abstract
Hjärtat myocyter isolerade från vuxna hjärtan är allmänt accepterad som modell någonstans halvvägs mellan embryonala och neonatal muskelceller på ena sidan och en fungerande hjärta på den andra. Således cardiomyocytes fungera som bra modeller för hjärt-cellulär fysiologi och patofysiologi, för läkemedels-utredningar samt för undersökning av transgena djurmodeller. Här beskriver vi en metod för att isolera celler från hjärtat. Dessutom visar vi hur en genetisk manipulation på hjärtats myocyter kan utföras utan avel en transgen djur: Detta är en kombination av långsiktiga kultur (1 vecka) och adenovirala genöverföring. Det senare ett beskrivs från byggandet av viruset till transduktion av cellerna. Den kan användas för uttrycket av genetiskt kodade biosensorer (GEBs), fluorescerande proteiner fusion, men även för protein över uttryck och ner reglering, t.ex. med RNAi. Här ger vi ett exempel på uttryck för en fusionsprotein färgning en subcellulära struktur (Golgi). Sådana proteinuttryck kan visualiseras genom konfokal avbildning av z-stackar för en 3D-rekonstruktion av subcellulära strukturer. Protokollet består av state-of-the-art i cellkultur, molekylärbiologi och biofysik och ger därmed en metod för att utforska nya horisonter i cellulär kardiologi.
Protocol
Discussion
Det förfarande som beskrivs för isolering av råtta cardiomyocytes kan anpassas till andra arter, t.ex. mus 4 om det behövs. En parameter som behöver anpassning är det enzym mix för rötning (se nedan) och även varaktigheten av matsmältningen. Var medveten om att cellerna på vissa arter (t.ex. mus) kan vara mer känsliga än andra (t ex råtta).
Valet av kollagenas är förmodligen det mest avgörande steget i isolering förfarande. Vi väljer Blendzyme Liberase eftersom …
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av den tyska National Science Foundation (DFG) och av det federala institutet för riskbedömning (BFR, Tyskland).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Anesthesia solution | Serumwerk Bernburg GmbH (Ursotamin), Bayer Health Care (Rompun) | Mixture of 1 ml Ursotamin (100 mg/ml Ketaminhydrochlorid) and 240 μl Rompun (2% Xylazinhydrochlorid) | ||
| Citrate solution | 117,64 mg sodium citrate in 10 ml 0.9% NaCl solution | |||
| Solution A | 134 mM NaCl, 4 mM KCl, 11 mM glucose, 1.2 mM MgSO4, 1.2 mM Na2HPO4, 10 mM HEPES, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered | |||
| Solution A+ | Content of solution A plus 0.2 mM EGTA, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered | |||
| Liberase solution | F. Hoffmann‐ La Roche Ltd. | 11988476 001 | 500 μl stock solution in 15 ml solution A (stock solution: 10 mg/ml Liberase Blendzyme 4 in aqua dest.) | |
| Solution B | Content of solution A plus 200 μM CaCl2 and 0.1% DNase solution | |||
| Solution B1/2 | 1:1 mixture of solution A and solution B | |||
| DNase solution | Sigma‐ Aldrich Co. | D4527 | Deoxyribonuclease I, Type 2 from bovine pancreas, 40 KU (15 mg) are dissolved in 5 ml of 10 mM Tris‐HCl buffer, adjusted to pH=7.35, additional content: 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM dithioerythritol; this solution is mixed with 5 ml glycerol | |
| Extracellular matrix protein (ECM) solution | Extracellular matrix protein (ECM) solution | E1270 | 1 ml stock solution as purchased is diluted with 6 mL medium M199 | |
| Culture medium M199 | PAA | E15‐834 | Medium M199 supplemented with 1 μl/ml ITS solution and 20 μl/ml penicillin‐streptomycin solution (5000 units/ml) | |
| ITS solution | 25 mg Insulin, 25 mg Transferrin and 50 μl Selenite stock solution are dissolved in 5 ml aqua dest. (stock solution: 0.5 mg/ml Sodiumselenite in aqua dest.). Add a few drops of 1 M HCl until one should get a clear solution. Aliquots can be frozen. | |||
| Tyrode | 135 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 2mM MgCl2, 10 mM glucose, 10 mM HEPES, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered | |||
| Master mix | 5 μl 10×PCR‐Buffer, 5 μl MgCl2 (25 mM), 2 μl forward primer, 2 μl reverse primer, 1 μl dNTP´s (10 mM each), 33 μl H2O, 1 μl DMSO, 1 μl Taq‐DNA polymerase for each sample | |||
| LB‐Medium | 10 g/l Tryptone, 5 g/l Yeast extract, 5 g/l NaCl (and 15 g/l Agar if used as solid medium), pH 7.0 | |||
| Pac I | New England Biolabs | R0547L | preparation: 50 μg DNA, 5 μl 10×buffer, 0.5 μl 100×BSA, 0.75 μl Pac I, fill with H2O up to final volume of 50μl |
Referências
- Kaestner, L., Ruppenthal, S., S, ., Licha, K., Lin, C. P. . Molecular Imaging II. Vol. 7370, 737008-737008 (2009).
- Viero, C., Kraushaar, U., Ruppenthal, S. In vivo imaging of Drosophila melanogaster pupae with mesoscopic fluorescence tomography. Cell Calcium. 43 (1), 59-59 (2008).
- Kaestner, L., Lipp, P., Shorte, S. L., Frischknecht, F. . Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 289-289 (2007).
- Kaestner, L., Lipp, P., Popp, J., von Bally, G. . Optics in Life Science. Vol. 6633, 66330K-66330K (2007).
- Rinne, A., Littwitz, C., Bender, K. Adenovirus-mediated delivery of short hairpin RNA (shRNA) mediates efficient gene silencing in terminally differentiated cardiac myocytes. Methods Mol Biol. 515, 107-107 (2009).
