मानव शवपरीक्षा मस्तिष्क के ऊतकों में एकल सेल आबादी से उच्च गुणवत्ता शाही सेना प्राप्त

Summary

हम एक लेजर कब्जा microdissection का उपयोग शाही सेना को अलग करने के लिए और एक सजातीय सेल की आबादी, शवपरीक्षा मानव दिमाग में बेहतर अस्थायी गाइरस की परत III में पिरामिड न्यूरॉन्स, से निकालने की प्रक्रिया का वर्णन. हम बाद में रैखिक mRNA (T7 आधारित) बढ़ाना, और Affymetrix मानव X3P माइक्रोएरे नमूना संकरण.

Abstract

हम बेहतर अस्थायी गाइरस में एक प्रकार का पागलपन रोगियों में देखा ग्रे मामले में कमी की जांच परत III में जीन पिरामिड न्यूरॉन्स की अभिव्यक्ति प्रोफाइल पूछताछ द्वारा प्रस्ताव रखा. यह सर्वविदित है कि प्रमस्तिष्क प्रांतस्था एक असाधारण विविध क्षेत्रों, परतों और प्रकार की कोशिकाओं, जिनमें से प्रत्येक का अलग सेलुलर और आणविक रचनाओं और इसलिए अंतर जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल द्वारा विशेषता है जिसमें विषम संरचना है. ऊतक विविधता के confounding प्रभावों को दरकिनार करने के लिए, हम लेजर कब्जा microdissection (LCM) का इस्तेमाल किया है ताकि हमारे विशेष सेल प्रकार यानी पिरामिड न्यूरॉन्स को अलग.

लगभग 500 पिरामिड Histogene धुंधला समाधान के साथ दाग न्यूरॉन्स Arcturus XT LCM प्रणाली का उपयोग कर कब्जा कर लिया गया. आरएनए तो कब्जा कर लिया कोशिकाओं से अलग किया गया था और T7 आधारित रैखिक प्रवर्धन Arcturus / आण्विक डिवाइसेज किट का उपयोग कर के दो राउंड लिया. Experion (जैव रेड) LabChip जेल और electropherogram अच्छी गुणवत्ता एक प्रतिलेख पिछले प्रोटीन के लिए आवश्यक 600nt विस्तार लंबाई के साथ एक शाही सेना (एम) ने संकेत दिया. प्राप्त mRNA की राशि 51μg औसत स्वीकार्य मतलब नमूना पवित्रता के साथ के रूप में 2.5 के A260/280 अनुपात, ने संकेत दिया है. जीन अभिव्यक्ति मानव Affymetrix से X3P GeneChip जांच सरणी का उपयोग profiled गया था.

Protocol

1) ऊतक सेक्शनिंग: हम हार्वर्ड मस्तिष्क के ऊतकों संसाधन केंद्र से आवश्यक ऊतक (नियंत्रण n = 9, एक प्रकार का पागलपन n = 9) प्राप्त की, उम्र, लिंग और शवपरीक्षा अंतराल (PMI) (तालिका 1) के लिए मिलान. तरल नाइट्रोजन वाष्प ब्लॉक लगभग 3mm मोटी Brodmann 42 क्षेत्र (बेहतर अस्थायी गाइरस) से ले जाया गया था. पिरामिड न्यूरॉन्स की धुंधला शुरू करने से पहले, शर्तों के क्रम में इष्टतम ऊतक "लिफ्ट" और उच्च शाही सेना गुणवत्ता प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. "लिफ्ट" ऊतक लेजर कब्जा microdissection प्रक्रिया के दौरान, जहां कब्जा करने के लिए चिह्नित न्यूरॉन्स टोपी का पालन कर रहे हैं और अलग जबकि शेष ऊतक पीछे छोड़ दिया है का वर्णन करता है. अनुकूलन: आदेश में RNase गतिविधि है, जो शाही सेना गुणवत्ता समझौता कम करने के लिए, कार्य क्षेत्र, एक RNase परिशोधन समाधान के साथ ब्लेड और स्लाइड सेक्शनिंग RNase जैप के रूप में, 100% इथेनॉल के साथ नीचे पोंछते के अलावा, सहित सभी सतहों, इलाज. Cryostat -17 पर सेट के साथ ऊतक धारा डिग्री सेल्सियस इस कमरे तापमान (स्लाइड्स), cryostat, और सूखी बर्फ (संपूर्ण नीचे प्रक्रिया को देखें) के बीच तापमान ढाल को कम कर देता है. यदि तापमान -20 डिग्री सेल्सियस से नीचे है, ऊतक वर्गों टुकड़ा करते हैं, उन्हें व्यर्थ प्रतिपादन. उच्च है, और तापमान ढाल बढ़ जाती है, जो शाही सेना अखंडता के साथ समझौता कर सकते हैं. वर्गों मोटी 8μm हो सकता है, के रूप में मोटा वर्गों अंततः ऊतक "लिफ्ट" समझौता होगा चाहिए. यह मोटाई भी कब्जा करने के लिए पिरामिड के न्यूरॉन्स की सही पहचान के लिए सक्षम बनाता है. सादे रूप में इन uncharged गिलास स्लाइड (जैसे Histogene LCM स्लाइड्स) का उपयोग ऊतक लेजर पर कब्जा प्रक्रिया के दौरान "लिफ्ट" के साथ हस्तक्षेप नहीं है. झिल्ली स्लाइड्स भी, प्रयोग किया जा सकता है लेकिन इन अधिक बड़े ऊतक संरचनाओं अलग करने के लिए अनुकूल हैं, के रूप में झिल्ली लेजर कब्जा प्रक्रिया के दौरान थोड़ा लिफ्ट, जिससे अवरक्त (IR) लेजर स्थान आकार में वृद्धि और सेल विशिष्टता कम जाता है. माउंट गिलास स्लाइड प्रति दो वर्गों, के रूप में स्लाइड प्रति दो से अधिक वर्गों के तापमान में सेक्शनिंग प्रक्रिया के दौरान शाही सेना गुणवत्ता निरंतर भिन्नता के कारण समझौता हो सकता है. सेक्शनिंग के बाद, स्लाइड तुरंत सूखी बर्फ पर एक माइक्रो स्लाइड बॉक्स में क्रम में शाही सेना अखंडता बनाए रखने के लिए जगह. मस्तिष्क वर्गों से युक्त स्लाइड बक्से बाद में -80 पर संग्रहीत डिग्री सेल्सियस जब तक संसाधित कर रहे हैं. हम पहले से निर्धारित किया है कि पिरामिड के न्यूरॉन्स के लिए, मामले के अनुसार 500 कोशिकाओं क्रम में माइक्रोएरे संकरण के लिए पर्याप्त शाही सेना अधिग्रहण पर्याप्त हैं. लगभग चार वर्गों मामले के अनुसार की जरूरत है मुख्य कारण कलाकृतियों सेक्शनिंग और धुंधला हो जाना. 2) पिरामिड न्यूरॉन्स की धुंधला: पिरामिड न्यूरॉन्स की पहचान Histogene जल्दी धुंधला समाधान और किट के साथ हासिल की है, के रूप में यह हमें इन न्यूरॉन्स की कल्पना करने के लिए, जलीय समाधान के लिए लंबे समय तक निवेश के बिना, जिससे शाही सेना के संरक्षण की अनुमति देता है. धुंधला समाधान (जैसे Promega) के 100μl के प्रति 1μl RNase अवरोध करनेवाला जोड़ने के क्रम में RNase गतिविधि को सीमित करने के लिए धुंधला हो जाना प्रक्रिया के लिए तैयार है. चार वर्गों (2 स्लाइड्स), RNase अवरोध करनेवाला के 4μl की आवश्यकता 400μl एक 1.5ml microcentrifuge ट्यूब (बर्फ पर रखा) में Histogene धुंधला समाधान के लिए जोड़ा. प्रत्येक अनुभाग के लिए, हम इस समाधान है, जो हमें देता है एक पर्याप्त दाग पिरामिड न्यूरॉन्स की पहचान की 97μl का उपयोग करें. धुंधला Histogene किट, अर्थात् 2×75%, 95%, 100% और RNase मुफ्त पानी के 2 जार के साथ प्रदान जार में उचित ethanols के विभाज्य 25ml: निर्जलीकरण श्रृंखला और xylene तैयार. एक बर्फ बाल्टी में एक 75% जार, जो आप ° -20 सी फ्रीजर में जगह के लिए छोड़कर, सभी जार रखें. एक धूआं हुड के तहत, Xylene जार में आणविक sieves को जोड़ने के लिए अतिरिक्त पानी है, जो ऊतक "लिफ्ट" समझौता हो सकता है निकालने के. के लिए 42 सेट तापमान के साथ waterbath (या गर्मी ब्लॉक) को स्विच ऑन ° सी और एक 50ml फाल्कन waterbath में एक रैक के द्वारा समर्थित ट्यूब जगह. -80 से दो स्लाइड्स निकालें डिग्री सेल्सियस और उन्हें defrost लगभग 30 सेकंड के लिए KimWipe पर, या बस जब तक स्लाइड के कोनों defrost करने के लिए शुरू. संक्षेप में 75% इथेनॉल में -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में 30 सेकंड के लिए स्लाइड्स तय कर लो. धुंधला RNase-zapped संदंश का उपयोग करने के लिए संक्रमण को कम करने के जार के बीच स्लाइड्स स्थानांतरण. Nuclease मुक्त पानी में 30 सेकंड धोने के बाद वर्गों पीएपी बाधा कलम के साथ रेखांकित किया जा सकता है क्रम में करने के लिए समाधान अनुभाग ध्यान केंद्रित करने के लिए, लेकिन सादे गिलास स्लाइड के साथ यह बिल्कुल आवश्यक नहीं है. Histogene धुंधला समाधान के साथ 20 सेकंड के लिए चार वर्गों अनुभाग प्रति दाग / RNase अवरोध करनेवाला के 97μl के साथ, दाग. बाद में, बर्फ पर पहले से तैयार ethanols में वर्गों कदम प्रति 30 सेकंड के लिए, निर्जलीकरण. अंतिम 100% इथेनॉल कदम 3 मिनट तक बढ़ाया जाना चाहिएआदेश में पर्याप्त ऊतक "लिफ्ट" के लिए पर्याप्त निर्जलीकरण को प्राप्त करने के लिए और LCM कैप पर कब्जा. एक और 5 मिनट पर कब्जा पूर्व के लिए एक हुड धूआं में 5 मिनट और हवा शुष्क लिए Xylene में स्लाइड्स को विसर्जित कर दिया. धुंधला कदम केवल अगर तुरंत बाद लेजर पर कब्जा किया जाना चाहिए. सभी समाधान हर 4-6 स्लाइड्स परिवर्तित किया जाना चाहिए क्रम में प्रदूषण को रोकने के लिए और उचित निर्जलीकरण सुनिश्चित. 3) सिंगल सेल लेजर कब्जा microdissection: धुंधला के बाद, परत III से पिरामिड न्यूरॉन्स लेजर कब्जा microdissection का उपयोग कर हटा रहे हैं Arcturus XT प्रणाली और सॉफ्टवेयर के साथ. संक्षेप में, सिस्टम एक थर्माप्लास्टिक फिल्म के माध्यम से एक टोपी के आधार पर स्थित एक समायोज्य शक्ति IR लेजर स्पंदन / ब्याज की कोशिकाओं पर सीधे विस्तार बढ़ाव फिल्म में जिसके परिणामस्वरूप द्वारा काम करता है. जब टोपी ऊतक से उठाया है, कोशिकाओं पर कब्जा कर लिया / टोपी पर कैद रहते हैं. एक सचित्र सारांश चित्रा 1 में दिया जाता है. इस प्रक्रिया शुरू करने से पहले, यह महत्वपूर्ण है करने के लिए इस प्रणाली के साथ उपलब्ध टोपी के दो प्रकार के बीच अंतर. है जबकि मैक्रो CapSure टोपी आम तौर पर बड़े ऊतकों संरचनाओं पर कब्जा करने के लिए प्रयोग किया जाता है, CapSure एच एस टोपी के लिए व्यक्ति की कोशिकाओं के छोटे संख्या पर कब्जा करने के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं और इसलिए इन टोपियां एक छोटे सतह पर कब्जा के लिए नामित क्षेत्र है. एच एस टोपियां भी पटरियों है कि ऊतक अनुभाग के साथ सीधे संपर्क में किया जा रहा से टोपी को रोकने के है, जबकि मैक्रो टोपी नहीं करता है. इन पटरियों ऊतक तह है कि प्रभावित या स्थान आकार की परिवर्तनशीलता लेजर पल्स () प्रेरित हो सकता है के रूप में मैक्रो टोपी मुड़ा, असमान ऊतक पर सीधे बैठता है के प्रभाव को कम. हमारे प्रक्रिया के लिए, हम एच एस टोपियां का इस्तेमाल उनके ऊतक तह के प्रभाव को कम करने की क्षमता का लाभ ले लो, लेकिन सॉफ्टवेयर पर मैक्रो टोपी सेटिंग्स रखा क्रम में कब्जा कर लिया क्षेत्र को अधिकतम करने के रूप में हम कक्षों की एक बड़ी संख्या पर कब्जा कर रहे हैं. Arcturus XT तंत्र पर स्लाइड और टोपी लोड. CapSure एच एस टोपी का प्रयोग करें, लेकिन मैक्रो पर कार्यक्रम सेटिंग को बनाए रखना. "सिंहावलोकन के साथ लोड" बॉक्स पर क्लिक करें प्रत्येक स्लाइड के एक सिंहावलोकन फोटो प्राप्त है. 2x बढ़ाई चमक / ध्यान समायोजित करने के लिए, क्रम में निर्धारित करने के लिए जो अनुभाग लेजर पर कब्जा करने के लिए इष्टतम किया जाएगा. से बचें अत्यधिक तह ऊतक वर्गों के साथ, बल्कि वर्गों है कि बरकरार, चिकनी कर रहे हैं, और अच्छी तरह से ब्याज यानी परत III के क्षेत्र के पास विशेष रूप से, दाग चुन. हम तो सामान्य क्षेत्र है जहां हम, पर कब्जा हो जाएगा परत क्ष्क्ष्क्ष् शामिल करना सुनिश्चित बनाने पर एक टोपी जगह है. 2x बढ़ाई पर फिर भी, यकीन है कि है कि किसी भी परतों पर टोपी रेल आराम नहीं, के रूप में इस टोपी झुकाव होगा. अगला, हम IR लेजर हाजिर के स्थान मैन्युअल पुष्टि 40x बढ़ाई. यदि स्पॉट (लाल किरण) नीले पार के साथ सहसंबंधी नहीं करता है, इस मौके पर सही क्लिक और "स्थित आईआर स्थान" का चयन करके समायोजित किया जा सकता है. 40x में, हम निम्नलिखित मानदंडों के अनुसार पिरामिड न्यूरॉन्स की पहचान शुरू कर सकते हैं (1) कोशिकाओं है कि आकार में पिरामिड हैं और (2) शिखर और / या बेसल dendrites के प्रॉक्सिमल भाग पहचाने जाने योग्य हैं (छवि 1A). अब हम शक्ति और लेजर पल्स अवधि को समायोजित क्रम में पिरामिड न्यूरॉन पर कब्जा है. यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, के रूप में यह कब्जा कर लिया कोशिकाओं की संख्या के अलावा में कब्जा कर लिया सेल की विशिष्टता को निर्धारित करता है. यदि नाड़ी भी कमजोर है नहीं सभी पहचान न्यूरॉन्स कब्जा हो जाएगा, जबकि अगर नाड़ी भी मजबूत है यह / ऊतक अकेले न्यूरॉन के अलावा अन्य कोशिकाओं के आसपास पर कब्जा कर सकता है. आम तौर पर, ऊतकों और सेल यहाँ कार्यरत विनिर्देशों के साथ, लेजर शक्ति (70mW) और 25μm की एक स्थान आकार में अवधि परिणाम (16msec) पिरामिड न्यूरॉन आकार के साथ लाइन में लगभग (छवि 1B). हालांकि, इन सेटिंग्स को प्रत्येक अनुभाग के लिए ठीक है देखते हैं क्रम में करने के लिए मामले के अनुसार मोटे तौर पर एक ही स्थान आकार प्राप्त. यदि "लिफ्ट" समझौता किया है, एक हमेशा पर कब्जा कर लिया कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि क्रम में शाही सेना की राशि प्रत्येक तुलनीय मामले से प्राप्त रखने के लिए कर सकते हैं. हालांकि, धुंधला सहित 1.5 घंटे के तहत अपने कब्जे समय, इस की तुलना में अब के रूप में शाही सेना गुणवत्ता में समझौता कर सकते हैं रखने के लिए सुनिश्चित हो. पहले स्थिति समारोह में धन चिह्न पर क्लिक करके टोपी की स्थिति से बचाने के लिए. इस तरह, अगर हम किसी भी कारण के लिए टोपी को हटा दें और फिर चाहिए यह एक ही स्थान पर वापस रख करने की आवश्यकता होगी, टोपी हमेशा ठीक उसी जगह के लिए वापस कि आप स्थान के लिए आकार समायोजित होगा. शक्ति और अवधि में 16 में 70: नियंत्रण बॉक्स में इन मूल्यों को दर्ज करें. Unclick "ऑटो चाल मंच" विकल्प है, और यह सुनिश्चित करें कि सही आकार प्रतीक सही करने के लिए पैनल पर प्रतीक के साथ संबद्ध. वृत्त (नीचे सही) विकल्प के लिए एक न्यूरॉन है कि आप कब्जा परीक्षण करना चाहते हैं का चयन करें, चुनें और फिर क्लिक करके लेजर सक्रिय"परीक्षण आईआर हाजिर" पर. लेजर द्वारा बनाया हाजिर सबसे पहले ऑब्जेक्ट के चारों ओर एक कुरकुरा अंधेरे अंगूठी पर कब्जा कर लिया है चाहिए. यदि यह अंगूठी भी प्रकाश है, सेल नहीं कब्जा कर लिया था. अगर वहाँ अंधेरे की अंगूठी के बीच में एक अंधेरे स्थान है, तो लेजर शक्ति / अवधि भी महान है, और यह आरएनए वर्तमान में कब्जा कर लिया सेल पर एक नकारात्मक प्रभाव हो सकता है. यकीन है कि अंगूठी काफी बड़ा सेल धरना, लेकिन काफी छोटा है कि यह अवांछित ऊतक या अन्य कोशिकाओं को शामिल नहीं करता है. ऊतक के विभिन्न भागों पर परत है कि आप पर कब्जा करने की इच्छा के भीतर प्रक्रिया दोहराएँ करने के लिए जाँच है कि स्थान आकार स्थान पर निर्भर करता है अलग नहीं है. तदनुसार समायोजित करें. एक बार लेजर हाजिर समायोजित किया गया है, के लिए कब्जा करने के लिए पिरामिड न्यूरॉन्स की पहचान जारी है. हम नमूना प्रति लगभग 500 कोशिकाओं है, जो नमूना प्रति कुल शाही सेना के लगभग 500pg में परिणाम की पहचान. हम भी आमतौर पर केवल क्रम में एक अनुभाग का उपयोग करने के लिए कब्जा समय की राशि को कम करने के रूप में टोपी के लिए प्रत्येक अनुभाग के लिए पुनः समायोजन किया जाना है. एक बार जब आप आप की जरूरत है सभी कोशिकाओं की पहचान की है, लेजर कब्जा बटन दबाएँ और अपने सभी कक्षों में स्वचालित रूप से टोपी (छवि 1C) पर कब्जा कर लिया जाएगा. एक बार सभी कक्षों पर कब्जा कर लिया गया है, स्लाइड है कि एक खंड शामिल नहीं करता है की एक अलग हिस्सा करने के लिए टोपी चाल है. जहां कोशिकाओं कब्जा कर लिया गया है वापस जाओ और सुनिश्चित करें कि न्यूरॉन्स के कम से कम 90% हटा दिया गया. यदि नहीं, तो एक ही कक्ष पुनर्ग्रहण की कोशिश नहीं की, लेकिन क्षेत्र है जहां कोशिकाओं का सबसे कब्जा कर लिया गया पता लगाने के लिए, और एक ही क्षेत्र में अधिक कक्षों पर कब्जा. QC स्टेशन के लिए टोपी ले जाएँ. एप्लाइड Biosystems (cat. N8010611 #) निष्कर्षण बफर के 50ml (PicoPure आरएनए अलगाव किट) युक्त से 0.5ml microcentrifuge ट्यूब में टोपी रखें. टोपी के लिए इस विशिष्ट ट्यूब में पूरी तरह से फिट करने के लिए लीक से बफर को रोकने के लिए डिजाइन किया गया है. विधानसभा मुड़ें ऊपर से नीचे, यकीन है कि निष्कर्षण बफर पूरे टोपी शामिल हैं बनाने, और यह 42 पर 50ml फाल्कन पहले से ही waterbath सेट में मौजूद ट्यूब के नीचे डिग्री सेल्सियस में जगह न्यूरॉन्स 30 मिनट के लिए incubated रहे हैं क्रम में टोपी से ऊतक निकालने. इसके बाद, ट्यूब और 800 ग्राम से कम 2 मिनट के लिए टोपी विधानसभा अपकेंद्रित्र. टोपी निकालें और -80 पर शेष सेल निकालने की दुकान ° C शाही सेना निकासी तक. एक अतिरिक्त एहतियात के रूप में, आप फिर से लेजर कैप्चरिंग तंत्र पर QC स्टेशन पर टोपी की जांच कर सकते हैं करने के लिए सुनिश्चित करें कि सभी न्यूरॉन्स टोपी खुद से हटा दिया गया है. 4) विशिष्ट neuronal आबादी से शाही सेना को प्राप्त करने: एक अलगाव के लिए पर कब्जा करने से सीधे चलते हैं, कर सकते हैं या -80 ° सी फ्रीजर में संग्रहीत नमूना पिघलना. हमारे प्रयोग में, हम पहले अलगाव शाही सेना आगे बढ़ने से पहले सभी आवश्यक और -80 में उन्हें संग्रहीत नमूनों ° सी एकत्र. आरएनए अलगाव PicoPure अलगाव किट है, जो LCM नमूनों से कोशिकाओं के छोटे संख्या को अलग करने और कम बहुतायत mRNA बनाए रखने के लिए डिज़ाइन किया गया है का उपयोग किया जाता है. आम तौर पर, हम प्रोटोकॉल का पालन करें कि किट के साथ शामिल है. नीचे, हम इस प्रक्रिया का एक बुनियादी विवरण दे. विगलन के बाद, 70% इथेनॉल (किट के साथ प्रदान की) और एक पूर्व वातानुकूलित शुद्धि स्तंभ पर अपकेंद्रित्र जोड़ने के क्रम में स्तंभ फ़िल्टर करने के लिए शाही सेना को बाँध. धोने के बाद, DNase के साथ शाही सेना इलाज के क्रम में डीएनए की पूरी हटाने को सुनिश्चित करने के लिए डीएनए के हस्तक्षेप के खतरे को खत्म करने. यह कदम वास्तविक समय QRT-पीसीआर जैसे बहाव के अनुप्रयोगों में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है. डीएनए पचाने में के बाद, वहाँ एक और धोने कदम है. जाँच करें कि कोई धोने बफर अन्य microcentrifuge ट्यूब को स्थानांतरित करने से पहले स्तंभ में रहता है, के रूप में अपने अंतिम नमूना में बफर के किसी भी उपस्थिति कम प्रवर्धन के लिए शाही सेना शुरू में परिणाम होगा. यह सुनिश्चित करने के लिए, हम 2.5 के बजाय मिनट से 2 मिनट के रूप में प्रदान की गई प्रोटोकॉल में सुझाव दिया है के लिए अंतिम धोने कदम अपकेंद्रित्र. अंत में, elution बफर जोड़ा और फिल्टर पर incubated 1 centrifugation द्वारा पीछा किया मिनट के लिए स्तंभ में, क्रम में करने के लिए कुल शाही सेना elute. पिपेट 1.3ul अलग 0.5ml ट्यूबों में नमूने के प्रत्येक के एक Experion HighSens LabChip चलाने के लिए. -80 में नमूने के बाकी रुक डिग्री सेल्सियस गुणवत्ता नियंत्रण बहुत महत्वपूर्ण है जब शाही सेना अलग, खासकर जब मात्रा में छोटा है, और जरूरत जैसे माइक्रोएरे प्रयोगों (15μg) के लिए, राशि, बड़े है. इसलिए निकाला शाही सेना प्रक्रिया भर में विभिन्न समय बिंदुओं पर गुणवत्ता नियंत्रण से गुजरना चाहिए. निकासी के बाद पहली होता है. हम electropherograms और आभासी Experion HighSens LabChip द्वारा उत्पन्न जेल की 18S/28S चोटियों के सकल परीक्षा के माध्यम से कुल शाही सेना अखंडता की स्थापना. इस विधि जल्दी है और मापन के दो मतलब है गुणवत्ता electropherogram और एक आभासी जेल (छवि 2) शाही सेना की जांच प्रदान करता है. यदि कुल शाही सेना की गुणवत्ता अपेक्षाकृत अच्छा (चित्र. 2A, बी बनाम सी, डी), हम तो रैखिक mRNA, जो कुल शाही सेना के लगभग 2% के लिए खातों amplifying के साथ आगे बढ़ना. 5) रैखिक प्रवर्धन: लेजर कब्जा कर लिया ऊतकों से निकाली गई शाही सेना के प्रवर्धन के लिए आवश्यक है क्रम में बाद माइक्रोएरे संकरण और QRT-पीसीआर प्रयोगों के लिए एक शाही सेना के एक पर्याप्त राशि का उत्पादन है. आदेश में संभावित T7 आधारित रैखिक प्रवर्धन के साथ उल्लेख किया घालमेल कर दिया है की संभावना को कम करने के लिए, हम शुरू लेजर कब्जा कर लिया ऊतक सामग्री की राशि को अधिकतम द्वारा आवश्यक प्रवर्धन के दौर की संख्या कम से कम. हमारे प्रारंभिक डेटा (नहीं दिखाया गया है) बताते हैं कि कुल ऊतकों कि लगभग 500 कोशिकाओं होते से निकाले शाही सेना के रैखिक प्रवर्धन (RiboAmp एचएस PLUS किट) के दो दौर ARNA के लगभग 50μg उत्पादन होगा – दोनों माइक्रोएरे और QRT-पीसीआर के प्रदर्शन के लिए पर्याप्त प्रयोगों. यदि संभव हो तो, 0.2ml और 0.5ml ट्यूबों के बीच थर्मल cycler और 0.5ml किट में दिए गए ट्यूबों में 0.5ml ब्लॉक का उपयोग करके नमूना के अनावश्यक स्थानांतरित से बचने. फिर, बाद प्रोटोकॉल एक किट के साथ प्रदान की है. यहाँ एक संक्षिप्त संस्करण में वर्णित है. कुल शाही सेना नमूना (11μl लगभग) प्रदान प्राइमर के 1μl जोड़ें और 65 में सेते ° सी, 5 मिनट के लिए 4 में द्रुतशीतन के बाद डिग्री सेल्सियस 1 मिनट के लिए. सुपरस्क्रिप्ट III के रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस और 42 पर सेते ° सी 1 घंटे के लिए के साथ पहली कतरा सीडीएनए घटकों को एक साथ जोड़ें. दूसरा कतरा सीडीएनए संश्लेषण के बाद, एक शुद्धि कॉलम के माध्यम से प्रदान परिणामस्वरूप सीडीएनए शुद्ध. यहाँ हम अनुशंसा करते हैं कि जब नमूना प्लस शुद्धि स्तंभ के लिए बाध्य बफर स्थानांतरित, नमूना ट्यूबों अपकेंद्रित्र दो बार – स्तंभ के लिए नमूना हस्तांतरण के बाद एक बार, 1μl नमूना के रूप में स्थानांतरण के बाद ट्यूबों के पक्षों पर रहता है. धोने प्रदान बफ़र्स साथ सीडीएनए धो और elution बफर के साथ शुद्ध सीडीएनए elute. इन विट्रो प्रतिलेखन घटकों में जोड़ें और 42 पर 6 घंटे के लिए सेते डिग्री सेल्सियस एक DNase कदम के बाद, buffers के साथ प्रदान परिणामस्वरूप ARNA शुद्ध, अंततः यह elution बफर के 12μl के कुल में eluting. शाही सेना रैखिक प्रवर्धन के दूसरे दौर की प्रक्रिया (अलग प्राइमरों के साथ – किट प्रोटोकॉल देखें), जिसके बाद और अधिक गुणवत्ता नियंत्रण कदम कार्यरत हैं. नमूना के एक उल लगभग mRNA प्रतिलेख और StdSens LabChip (Experion) के साथ लंबाई एकाग्रता का निर्धारण 250ng/ul पतला है. पारंपरिक Affymetrix माइक्रोएरे प्रौद्योगिकी mRNA लंबाई में कम से कम 600 nucleotides करने के क्रम में पता लगाया जा आवश्यकता है. जेल और electropherogram LabChip से प्राप्त इसलिए इस न्यूनतम mRNA प्रतिलेख लंबाई (3 छवि) का वर्णन करना चाहिए. एक अतिरिक्त गुणवत्ता नियंत्रण NanoDrop स्पेक्ट्रोफोटोमीटर विश्लेषण है, जहां एक दो ऑप्टिकल घनत्व, यानी A260 और A280 बना अनुपात, शाही सेना शुद्धता निर्धारित करता है के माध्यम से निर्धारित किया जाता है. 2.1 चारों ओर एक ऑप्टिकल घनत्व के साथ नमूने जीन अभिव्यक्ति के विश्लेषण के लिए लेबल किया जाना चाहिए, हालांकि 2.7 करने के लिए ऊपर अनुपात करने के लिए तुलनीय संकरण गुणवत्ता है दिखाया गया है. एकाग्रता भी 800ng/μl-1μg/μl के बीच होना चाहिए, क्योंकि इस से कम जबकि भंडारण में गिरावट शाही सेना (-80 ° C से नीचे तापमान पर भी) का नेतृत्व किया गया है और भी गरीब माइक्रोएरे परिणाम के लिए नेतृत्व. 6) बायोटिन लेबलिंग Affymetrix माइक्रोएरे विश्लेषण के लिए mRNA के नमूने: आण्विक उपकरण से टर्बो बायोटिन लेबलिंग किट (अंत लेबलिंग) प्रवर्धित नमूनों से प्राप्त ARNA लेबल के लिए प्रयोग किया जाता है. प्रोटोकॉल का एक छोटा संस्करण यहाँ दी गई है. 13μl कुल nuclease – मुक्त पानी जोड़कर या एक वैक्यूम अपकेंद्रित्र में नमूना ध्यान दे, प्रारंभिक एकाग्रता पर निर्भर करता है द्वारा प्रत्येक ARNA नमूने के 20 μg की मात्रा समायोजित करें. हालांकि केवल 15μg Affymetrix इस्तेमाल किया चिप के लिए आवश्यक है, हम प्रारंभिक प्रतिक्रिया 20μg जोड़ने के लिए, के रूप में कुछ शाही सेना ऊष्मायन और centrifugation के दौरान खो दिया है. 85 पर बायोटिन प्रतिक्रिया ° C से 30 मिनट के लिए सेते हैं, और फिर 4 बजे शांत रहो डिग्री सेल्सियस विशेष किट के साथ प्रदान स्तंभ के साथ centrifugation के माध्यम से अतिरिक्त बायोटिन लेबल निकालें. कुछ मामलों में, जैसे FFPE (formalin-तय, आयल एम्बेडेड) नमूनों से प्राप्त अपमानित mRNA के साथ विशेष रूप से, यह मामला है कि नहीं mRNA सभी एकल centrifugation चरण में eluted है हो सकता है. हम तो अतिरिक्त 1-5μl nuclease मुक्त पानी के बीच एक 1 मिनट के बाद अतिरिक्त centrifugation कदम के साथ स्तंभ जोड़ने की अनुशंसा. यह सुनिश्चित करता है कि लेबल नमूना के सबसे eluted है. अंतिम मात्रा 20μl 1μg/μl के एक एकाग्रता के साथ है. यदि अतिरिक्त पानी nuclease मुक्त जोड़ा गया है, के लिए नमूने ध्यान केंद्रितएक वैक्यूम अपकेंद्रित्र के साथ सही मात्रा. हम 800ng/μl अधिक संकरण शुरू करने से पहले का भंडारण एकाग्रता रखने की सलाह देते हैं, के रूप में हमने पाया है कि इस कम से कम भंडारण और / या संकरण के दौरान गरीब माइक्रोएरे परिणामों में जिसके परिणामस्वरूप गिरावट के लिए नेतृत्व करेंगे. ARNA तो संकरित और जीन अभिव्यक्ति profiled, Affymetrix से मानव X3P GeneChip जांच सरणी का उपयोग कर. इस चिप के रूप में और अधिक अपमानित ARNA के लिए डिजाइन किया गया था, हम यह एक एहतियात के रूप में इस्तेमाल किया, के रूप में कई कारकों हम नियंत्रित नहीं कर सकते शवपरीक्षा ऊतकों की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते हैं. जैसा कि हमारे प्रयोगशाला संकरण के लिए पर्याप्त सुविधाएं नहीं था, प्रक्रिया भागीदार के लिए जीनोमिक कोर सुविधा पर प्रदर्शन किया गया था. प्रतिनिधि परिणाम: सेक्शनिंग 1 +2 +3) ऊतक, पिरामिड न्यूरॉन्स और लेजर कब्जा microdissection के धुंधला हो जाना: ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल दो स्लाइड्स में स्लाइड प्रति चार वर्गों के साथ परिणाम चाहिए. प्रत्येक अनुभाग न्यूनतम फाड़, खुर और तह के साथ चिकनी किया जाना चाहिए. सही धुंधला के साथ, लगभग 20 दाग अंधेरे में दाग पिरामिड न्यूरॉन्स की पहचान करेगा – एक पिरामिड आकार और दृश्य शिखर dendrites के साथ आकार में 25μm. अनुभाग / कुल शाही सेना के कम से कम 500pg में जिसके परिणामस्वरूप मामले प्रति 700 कोशिकाओं – मैक्रो सेटिंग्स पर CapSure एचएस टोपियां, और लेजर शक्ति और प्रत्येक अनुभाग के लिए ताकत का सही समायोजन के साथ, आप 500 के आसपास प्राप्त करना चाहिए. लगभग 85 – न्यूरॉन्स की 100% टोपी (1 छवि) का पालन करना होगा. 4) विशिष्ट neuronal आबादी से शाही सेना को प्राप्त करने: के रूप में कुल शाही सेना के अलगाव के बाद वर्णित है, हम electropherogram और जैव रेड Experion के माध्यम से आभासी जेल के माध्यम से शाही सेना गुणवत्ता की जांच. Electropherogram में, आप दो अलग चोटियों 18s और 28S ribosomal शाही सेना इकाइयों को इसी देखना चाहिए. शवपरीक्षा ऊतकों के साथ, तथापि, यह हमेशा मामला नहीं है, के रूप में ऊतक अपमानित सेक्शनिंग करने के लिए कारकों की वजह से पहले किया जा सकता है. आप सामान्य रूप से 18s के चारों ओर एक बड़ी चोटी है, और एक छोटे 28S चोटी (छवि 2A, बी) के साथ एक बड़ी टक्कर के संकेत गिरावट देखेंगे. के रूप में लंबे समय के रूप electropherogram प्रोफाइल नमूने भर में तुलना कर रहे हैं, हम इस निर्देश में पाया गया है mRNA काफी अच्छा प्रदर्शन करने के लिए दोनों RT-पीसीआर और माइक्रोएरे पढ़ाई (Imbeaud एट अल., 2005) गुणवत्ता में परिणाम. अगर वहाँ बहुत अधिक गिरावट है – के रूप में electropherogram की वक्र के तहत एक बड़े क्षेत्र से संकेत दिया है, या अगर चोटियों दिखाई नहीं कर रहे हैं (छवि 2C, डी) – कोशिकाओं ऊतकों से फिर से कब्जा कर लिया जाना चाहिए. हम भी पहले कोशिकाओं वापसी के लिए तय है कि ऊतक ब्लॉक ही पदावनत है एक परीक्षण ऊतक परिमार्जन, जहां शाही सेना अनुभाग (न सिर्फ कोशिकाओं) के पूरे टुकड़े से निकाला जाता है कर की सिफारिश करेगी. 5) रैखिक प्रवर्धन: रैखिक प्रवर्धन के दो राउंड के बाद mRNA की गुणवत्ता का परीक्षण करने के लिए, हम दोनों जैव रेड Experion StdSens LabChip और NanoDrop स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग किया. पारंपरिक Affymetrix माइक्रोएरे प्रौद्योगिकी mRNA लंबाई में कम से कम 600 nucleotides के क्रम में पता लगाया जा, जो इस प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त किया गया था करने की आवश्यकता है है. वास्तव में, mRNA लंबाई 1000 nucleotide रेंज में पाया गया. electropherogram भी बड़े चोटियों धीरे धीरे समय के एक समारोह (छवि 3A, बी) के रूप में उतरते के साथ इस दर्शाता है. NanoDrop रीडिंग नमूने भर A260/A280 अनुपात 2.5 के औसत का संकेत है, व्यवहार्य mRNA (तालिका 2) का संकेत है. हमारे परिणामों से संकेत मिलता है कि इस प्रोटोकॉल के साथ, दोनों मात्रा और शाही सेना की गुणवत्ता प्राप्त Affymetrix मानव X3P GeneChip के माध्यम से जीन अभिव्यक्ति मतभेद पूछताछ काफी अच्छा है. 6) बायोटिन लेबलिंग Affymetrix माइक्रोएरे विश्लेषण के लिए mRNA के नमूने: Affymetrix मानव X3P GeneChip संकरण के बाद, हम 26.6% (तालिका 2) के एक औसत के प्रतिशत कॉल हासिल की है, पर्याप्त संकरण और जांच तीव्रता का संकेत है. तालिका 1: पलटन सारांश नमूने समूह लिंग आयु PMI C1 नियंत्रण एफ 79 15.00 C2 नियंत्रण एम 22 21.47 C4 नियंत्रण एम 75 20.25 C5 नियंत्रण एम 80 15.50 C6 नियंत्रण एफ 58 21.08 C8 नियंत्रण एम 61 17.00 C10 नियंत्रण एफ 71 20.50 C11 नियंत्रण एफ <tघ 90> 12.66 C12 नियंत्रण एफ 86 6.92 मतलब 4M/5F 69.11 16.71 S1 SCHIZOPH. एफ 93 6.92 S2 SCHIZOPH. एम 55 21.40 S3 SCHIZOPH. एफ 67 21.80 S4 SCHIZOPH. एफ 55 22.00 S5 SCHIZOPH. एम 36 17.97 S6 SCHIZOPH. एम 62 10.75 S8 SCHIZOPH. एफ 92 17.80 S11 SCHIZOPH. एम 56 21.83 S12 SCHIZOPH. एफ 88 13.33 मतलब 4M/5F 68.11 16.90 लघुरूप: एफ – पुरुष PMI – महिला, एम शवपरीक्षा अंतराल, schizoph. – एक प्रकार का पागलपन. तालिका 2: परिणामों का सारांश आरएनए एकाग्रता, गुणवत्ता, और संकरण दक्षता चित्रण नमूने [MRNA] एनजी / उल A260/A280 जांच तीव्रता प्रतिशत कॉल C1 1318.01 2.67 63 19.5 C2 2312.93 2.37 147 30.6 C4 1811.92 2.44 69 26.6 C5 1316.26 2.51 78 34.7 C6 1663.24 2.39 66 33.8 C8 633.05 2.54 101 15.2 C10 1326.4 2.47 92 32.5 C11 994.24 2.75 76 22.4 C12 817.23 2.7 56 15.2 S1 2560.88 2.47 78 25.0 S2 2169.61 2.43 76 26.5 S3 2067.32 2.52 87 22.1 S4 1563.89 2.75 82 28.1 S5 2071.44 2.44 88 28.2 S6 2532.59 2.34 72 30.7 S8 2189.22 2.5 62 31.8 S11 1669.89 2.47 41 27.3 S12 1739.35 2.47 42 28.0 मतलब 1708.75 2.51 76.44 26.57 चित्रा 1: लेजर कब्जा microdissection प्रक्रिया का सारांश ए) पिरामिड न्यूरॉन्स आकृति विज्ञान की पहचान कर रहे हैं. बी) के बाद लेजर थर्माप्लास्टिक फिल्म के माध्यम से स्पंदित है, कोशिकाओं टोपी पालन इसलिए कर रहे हैं और अब कोई स्लाइड पर, आसपास के ऊतकों को छोड़ने के पीछे. सी) एक सजातीय सेल की आबादी का photomicrograph लेजर पर कब्जा करने के बाद CapSure कैप पर पालन. चित्रा 2: कुल शाही सेना गुणवत्ता नियंत्रण A + B) अलगाव के बाद अच्छी गुणवत्ता कुल शाही सेना का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि सी + डी) दिखाता कुल शाही सेना के अलगाव के बाद की तरह नहीं दिखना चाहिए. ए) (बी) में आभासी जेल के साथ स्पष्ट 18/28S इसी चोटियों के साथ एक electropherogram. सी) एक electropherogram वक्र के तहत एक बड़े क्षेत्र को दिखा रहा है और कोई 18S/28S शाही सेना गिरावट का संकेत चोटियों. यह भी आभासी जेल (डी) में दिखाया गया है. चित्रा 3: mRNA गुणवत्ता नियंत्रण ए + बी) (ए) Electropherogram और आभासी जेल (बी) का संकेत mRNA प्रतिलेख लेंग(प्रसार) वें माइक्रोएरे अध्ययन के लिए आवश्यक है, यानी पिछले 600 nucleotides (NT) का विस्तार. सी + डी) (सी) Electropherogram और आभासी जेल (डी) दिखा रहा है क्या पसंद है, एक अपर्याप्त mRNA प्रसार mRNA प्रतिलेख लंबाई के रूप में पिछले 200nt विस्तार नहीं करता है देखना होगा.

Discussion

यहाँ, हम विषम शवपरीक्षा मस्तिष्क ऊतक Arcturus XT प्रणाली और संबंधित शाही सेना निकासी किट का उपयोग कर से सजातीय सेल आबादियों को निकालने के लिए अनुकूलित करने के लिए एक प्रोटोकॉल करने का प्रयास. जैसा कि ऊपर उल्लिखित है, हम कुछ संशोधनों के मूल कंपनी द्वारा उपलब्ध कराई प्रोटोकॉल के लिए बनाया है, क्रम में आरएनए अखंडता को अधिकतम. एकल कक्षों के सफल कैप्चरिंग कदम पहले अनुकूलन पर कब्जा करने के लिए आदेश में अच्छा शाही सेना के साथ अधिकतम कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए पर पूरी तरह निर्भर करता है. इन चरणों विभिन्न सेक्शनिंग और धुंधला ऊतक के साथ जुड़े मानकों में शामिल हैं. संक्षेप में, ऊतक तैयारी के संबंध के साथ इन में शामिल हैं: 1) तापमान ढाल कम जब, 2 सेक्शनिंग) केवल स्लाइड प्रति 2 वर्गों, 3) रखने बर्फ पर सभी निर्जलीकरण कदम प्रदर्शन, 4) दाग 5, RNase अवरोध करनेवाला जोड़ने) बढ़ती अंतिम 100% 3 मिनट के लिए इथेनॉल में निर्जलीकरण की अवधि.

के साथ संबंध है पर कब्जा करने के लिए, हमें लगता है कि मैक्रो सेटिंग पर सॉफ्टवेयर के साथ CapSure एचएस टोपियां, के संयोजन इष्टतम परिणाम यह सुनिश्चित करना चाहिए. नमी नियंत्रित वातावरण पर कब्जा एकल कोशिकाओं के लिए महत्वपूर्ण है, के रूप में उच्च आर्द्रता काफी ऊतक "लिफ्ट" कम कर देता है. उच्च तापमान भी शाही सेना गुणवत्ता पर एक नकारात्मक प्रभाव हो सकता है.

PicoPure किट के साथ शाही सेना अलगाव प्रोटोकॉल के दौरान, वहाँ दो धोने कदम उठाए हैं. यह महत्वपूर्ण है करने के लिए जाँच लें कि सभी धोने बफर आरएनए elution के लिए दूसरे microcentrifuge ट्यूब को स्थानांतरित करने से पहले हटा दिया जाता है, अपने अंतिम नमूना में बफर के किसी भी उपस्थिति के प्रवर्धन के लिए कम शुरू शाही सेना के रूप में परिणाम होगा. यह सुनिश्चित करने के लिए, हम 2.5 के बजाय मिनट से 2 मिनट के रूप में प्रदान की गई प्रोटोकॉल में सुझाव दिया है के लिए अंतिम धोने कदम अपकेंद्रित्र.

अधिकांश भाग के लिए, रैखिक प्रवर्धन प्रोटोकॉल के निर्माता के निर्देशों के अनुसार किया गया था. हालांकि, दो महत्वपूर्ण अंक खाते में लिया जाना चाहिए जब इस प्रोटोकॉल का उपयोग: 1) ट्यूबों के बीच, केवल 0.5ml थर्मल cycler में एक 0.5ml ब्लॉक के साथ संयोजन के रूप में प्रदान की ट्यूबों का उपयोग करके नमूनों की अतिरिक्त स्थानांतरित माध्यम से शाही सेना के नुकसान को सीमित करने की कोशिश , और 2) जब सीडीएनए की शुद्धि के लिए शुद्धि स्तंभ के लिए नमूना हस्तांतरण, पहली स्थानांतरण के बाद नीचे नमूना ट्यूबों स्पिन करने के लिए सुनिश्चित हो. यह एक अतिरिक्त 1 शुद्धि स्तंभ जोड़ सकते हैं और इसलिए सीडीएनए वसूली में वृद्धि कर सकते हैं नमूना के 2ul में परिणाम देगा.

जब टर्बो किट अंत लेबलिंग के बायोटिन अपने सीमित ARNA नमूनों की लेबलिंग के लिए इस्तेमाल कर रही है, हम बताते हैं एक अतिरिक्त कुछ μl जोड़ने centrifugation कदम से पहले पानी की है, को बढ़ाने के लिए लेबल शाही सेना स्तंभ से निकाले उपज. Centrifugation के एक अतिरिक्त मिनट भी इस संबंध में मदद करेंगे, खासकर अगर आप FFPE ऊतक के रूप में अपमानित ऊतक, के साथ काम कर रहे हैं.

हमें विश्वास है कि इस प्रोटोकॉल उपयोगकर्ता heterogenous शवपरीक्षा मस्तिष्क के ऊतकों के भीतर एक सेल आबादी, जैसे छोटे सजातीय संरचना, को अलग करने के लिए सक्षम हो जाएगा लगता है. यह आसपास के ढांचे और अन्य सेल प्रकार मस्तिष्क के भीतर विभिन्न परतों में स्थित के कमजोर पड़ने प्रभाव, जांच के तहत विशेष सेल प्रकार की ओर लक्षित परिणामों के लिए अग्रणी को कम कर देता है. परिणामस्वरूप शाही सेना की गुणवत्ता के रूप में माइक्रोएरे अध्ययन के लिए काफी अच्छा है, हम विशेष सेल रोग राज्यों में प्रभावित आबादी के विशिष्ट आणविक हस्ताक्षर तुच्छ शुरू कर सकते हैं.

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
4.5” Forceps		VWR	82027-392
Arcturus XT™ Laser-Capture Microdissection (LCM) System		MDS Analytical Technologies	13821-00
CapSure™ HS LCM Caps		MDS Analytical Technologies	LCM 0214
CapSure® Macro LCM Caps		MDS Analytical Technologies	LCM 0211
Experion™ Automated Electrophoresis Station		Bio-Rad	700-7001
Experion™ RNA HighSens Chips		Bio-Rad	700-7155	10 chips
Experion™ RNA HighSens Reagents		Bio-Rad	700-7156	10 chips
Experion™ RNA StdSens Chips		Bio-Rad	700-7153	10 chips
Experion™ RNA StdSens Reagents		Bio-Rad	700-7154	10 chips
Falcon® polypropylene Conical tube		Becton-Dickinson Labware	352070
GeneAmp® thin-walled reaction tube with domed cap		Applied Biosystems	N8010611
GeneChip® Human X3P array		Affymetrix	900516	6 chips
Histogene® LCM Frozen Section Staining kit		MDS Analytical Technologies	KIT0401	For staining solution, jars, ethanols and Xylene
Histogene™ LCM slides		MDS Analytical Technologies	12231-00
Micro Slide Box		VWR	48444-004
Microm HM 505E cryostat		Thermo Scientific	22-050-350	Catalogue number for similar product as current product no longer available
Microprocessor Controlled 280 series Water bath		Thermo Electron Corporation	51221048	Model 282
Molecular Sieve		EMD™	MX1583L-1
NanoDrop 1000 Spectrophotometer		Thermo Scientific	n/a	The NanoDrop 1000 is not available anymore, but the NanoDrop 2000 is comparable.
Nuclease-free water		Ambion®	AM9932
PEN Membrane glass slides		MDS Analytical Technologies	LCM 0522
PicoPure® RNA Isolation kit		MDS Analytical Technologies	KIT0204
RiboAmp®HSPLUS with Biotin labeling		MDS Analytical Technologies	KIT0511B	12 reactions Includes TURBO biotin labeling™ kit
RNase Zap®		Ambion®	AM9780/2
RNase-Free DNase Set		Qiagen	79254
RNasin® Plus		Promega	N261B
SuperScript™ III Reverse Transcriptase		Invitrogen	18080-044