Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen door herprogrammeren embryonale fibroblasten van muizen met een vier transcriptiefactor, Doxycycline Induceerbare Lentivirale transductiesysteem

Summary

De Stemgent Dox Induceerbare Mouse TF lentivirus Set kan herprogrammeren muis embryonale fibroblasten (MEF) om geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen. Hier hebben we het protocol voor DOX-induceerbare expressie van muis herprogrammering transcriptiefactoren Oct4 te tonen, om Sox2, Klf4 en c-Myc genereren iPS kolonies die uitdrukken gemeenschappelijke MES pluripotentie markers.

Abstract

Met behulp van een gedefinieerde set van transcriptiefactoren en celcultuur condities, Yamanaka en zijn collega's toonden aan dat retrovirus-gemedieerde levering en expressie van Oct4, Sox2, c-Myc en Klf4 in staat is om pluripotentie in muis fibroblasten. ¹ Latere rapporten hebben aangetoond dat het nut van de doxycycline (DOX) induceerbaar lentivirale levering systeem voor het genereren van zowel de primaire en secundaire iPS cellen van een verscheidenheid van andere volwassen muis somatische celtypen. ^2,3

Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen zijn vergelijkbaar met embryonale stamcellen (ES) cellen in morfologie, verspreiding en het vermogen om teratoom vorming induceren. Beide typen cellen kunnen worden gebruikt als de pluripotente uitgangsmateriaal voor de productie van gedifferentieerde cellen of weefsels in regeneratieve geneeskunde. ^4-6 iPS cellen ook een duidelijk voordeel ten opzichte van ES-cellen hebben als ze vertonen de belangrijkste eigenschappen van embryonale stamcellen, zonder het ethische dilemma van embryo vernietiging.

Hier laten we zien het protocol voor herprogrammering muis embryonale fibroblasten (MEF) cellen met het Stemgent DOX Induceerbare Mouse TF lentivirus Set. We hebben ook laten zien dat de Stemgent DOX Induceerbare Mouse TF lentivirus Set is in staat om uit te drukken elk van de vier transcriptiefactoren bij de transductie in MEFs en veroorzaakt daardoor een pluripotente stamcellen staat dat de pluripotentie markers kenmerk van ES-cellen weergegeven.

Protocol

<p class="jove_title"> 1. Virale Transductie van MEFs</p><ol><li> De dag voor het begin van het experiment, een jas 15 cm celkweek schotel met 0,2% gelatine steriel gefilterd in DDH₂ O. 'S nachts Incubeer de plaat bij 37 ° C en 5% CO₂.</li><li> Zuig de vloeistof uit de gelatine gecoate schaal, en het zaad MEF cellen (we gebruikten Nanog-GFP/rtTA MEF cellen) bij een dichtheid van 4×10⁵ Cellen per schotel. Incubeer de cellen in 30 ml van de MEF groeimedium (450 ml DMEM aangevuld met 50 ml FBS, 5 ml 100x niet-essentiële aminozuren, 5 ml penicilline / streptomycine, 5 ml 200 mM L-glutamine en 0,5 ml 55mm β-mercapto-ethanol) voor de twee dagen bij 37 ° C en 5% CO₂ Tot ongeveer 80% confluent.</li><li> Zuig het medium en voeg 30 ml van de MEF groei medium aangevuld met geconcentreerd lentivirus (4 x 100 pi virus stockoplossing + 29,6 ml groeimedium). Schud de schotel een gelijkmatige verdeling van het medium te verzekeren. Incubeer de cellen gedurende de nacht bij 37 ° C en 5% CO₂.</li></ol><p class="jove_title"> 2. Doxycycline Induced herprogrammeren</p><ol><li> 20-24 uur post-transductie, trypsinize de getransduceerde cellen, centrifugeer op 200 xg gedurende 5 minuten en resuspendeer in ES / IPS groeimedium (450 ml Knockout DMEM aangevuld met 50ml ES cel-gekwalificeerde kalfsserum, 5 ml penicilline / streptomycine, 5 ml 200 mM L-glutamine, 0,5 ml β-mercapto-ethanol en 25 ul LIF). Zaad getransduceerde MEF's op een geschikte concentratie voor de celcultuur schotel (wij gebruikten 2,5 x 10⁵ Cellen per 10 cm schotel voor herprogrammering efficiency experimenten en kolonie isolatie, en 2 x 10⁴ Cellen per putje in vier platen goed voor ICC experimenten). Incubeer overnacht bij 37 ° C en 5% CO₂. Opmerking: alle resterende getransduceerde cellen kunnen worden ingevroren in vloeibare stikstof voor toekomstige analyse.</li><li> Zuig het medium en vervang deze door ES / IPS medium vers bereid en aangevuld met doxycycline tot een uiteindelijke concentratie van 2 ng / ml (hebben we ook medium toegevoegd zonder DOX als een negatieve controle). Incubeer bij 37 ° C en 5% CO₂.</li></ol><p class="jove_title"> 3. Immunocytochemische Analyse van de transductie-efficiëntie</p><p class="jove_content"> 48 uur na doxycycline inductie bepalen transductie-efficiëntie door middel van immunohistochemie (ICC). Uit te voeren ICC testen op cellen opnieuw uitgeplaat in 4 well platen. Alle volumes die in de volgende protocol moet worden aangepast aan de celkweek plaat grootte.</p><ol><li> Was de cellen voorzichtig een keer met PBS (zonder Mg^{2 +} + Of Ca^{2 +}).</li><li> Fixeer de cellen met 500 pi van 0,5 ml 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.</li><li> Voorzichtig twee keer Was de cellen met PBS.</li><li> Permeabilize cellen door het toevoegen van 500 pi van ijskoude 0,2% Tween ® -20 in PBS. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.</li><li> Voorzichtig twee keer Was de cellen met PBS.</li><li> Blokkeren niet-specifieke binding met 200 ul blokkeerbuffer gedurende een uur bij kamertemperatuur.</li><li> De cellen 's nachts Incubate met 200 ul van de specifieke primaire antilichaam bij 4 ° C (we gebruikten Oct4, Klf4, Sox2 en c-Myc).</li><li> Voorzichtig twee keer Was de cellen met PBS.</li><li> Incubeer de cellen met 200 ul van secundaire antilichaam gedurende 1 uur bij kamertemperatuur, de bescherming van de platen van licht (wij gebruikten Donkey anti-Rabbit Rhodamine conjugaat, Donkey anti-Goat AlexaFluor ® 594 conjugaat, Donkey anti-Mouse Rhodamine conjugaat en Donkey anti -Rabbit Rhodamine conjugaat).</li><li> Voorzichtig twee keer Was de cellen met PBS.</li><li> Voeg DAPI (eindconcentratie 2 ug / ml in PBS) en 10 minuten om kernen te visualiseren broeden.</li><li> Voorzichtig Was de cellen met PBS.</li><li> Add anti-fade Aqua-Mount voordat beeldvorming met behulp van een omgekeerde fluorescentie microscoop.</li></ol><p class="jove_title"> 4. Isoleren en uit te breiden iPS Cell Colonies</p><ol><li> Na de inleiding van de herprogrammering proces (zoals beschreven in paragraaf 2), toezicht op de culturen en vervang medium om de 48 uur. We gebruikten doxycycline bevattend medium om de cultuur van de cellen voor de eerste twaalf dagen en dan vervolgens verwijderd doxycycline van het medium om ervoor te zorgen dat de iPS kolonies handmatig geplukt voor uitbreiding zou zijn DOX onafhankelijk.</li><li> Cellen moet dagelijks worden gecontroleerd op morfologische veranderingen die een aanwijzing van de herprogrammering proces, of bij het gebruik van cellen zoals Nanog-GFP/rtTA MEF, monitor morfologie en GFP-fluorescentie te herprogrammeren kolonies te identificeren. Elk experiment zal anders zijn, maar kolonies zijn over het algemeen groot genoeg voor de isolatie tussen de 16 en 22 dagen. Kolonies die tijdens deze periode kan dan handmatig worden geïsoleerd en getrypsiniseerd voor uitbreiding en analyse.</li><li> De dag voor het isoleren en trypsinizing het opnieuw geprogrammeerd koloniën, bereiden een 24-wells plaat door zaaien met gamma-bestraalde feeder layer MEFs bij een dichtheid van 5 x 10⁴ Cellen per putje. Incubeer overnacht bij 37 ° C en 5% CO₂.</li><li> Handmatig pick elk iPS kolonie en trypsinize naar de cel aggregaten dissociëren. Re-bord van de iPS cellen in ES / iPS medium in individuele putjes van de 24-well plaat pre-bezaaid met gamma-bestraalde feeder layer MEFs. Wells moet worden uitgezet met een dichtheid van 2 x 10⁵ Cellen / well. Incubeer bij 37 ° C en 5% CO₂. Verandering media elke 24 uur.</li><li> Monitor iPS kolonies dagelijks voor de groei en de GFP fluorescentie. We incubeer onze culturen gedurende 6 dagen voor de passage.</li><li> Bepaal welke gelijkmatig putten van de 24-well plaat zijn GFP uiten. Wells dat een goede GFP expressie hebben, kan worden getrypsiniseerd en gepasseerd 01:08 in 4-well platen die zijn pre-bezaaid met gamma-bestraalde feeder layer MEFs. Deze platen kunnen worden gebruikt voor pluripotent marker analyse door ICC en AP vlekken.</li></ol><p class="jove_title"> 5. Immunocytochemische Analyse voor pluripotentie</p><p class="jove_content"> Onze ICC onderzoeken zijn uitgevoerd op cellen uitgebreid in vier well platen. Alle volumes die in de volgende protocol moet worden aangepast aan de celkweek plaat grootte.</p><ol><li> Voorzichtig Was de cellen twee keer met PBS (zonder Mg^{2 +} + Of Ca^{2 +}).</li><li> Incubeer in 0,5 ml ijskoude 0,2% Tween 20 in PBS per goed voor 10 minuten.</li><li> Was de cellen voorzichtig drie keer met PBS.</li><li> Blokkeren niet-specifieke binding met 200 ul blokkeerbuffer gedurende een uur bij kamertemperatuur.</li><li> De cellen 's nachts Incubate met 200 ul van de specifieke primaire antilichaam bij 4 ° C (gebruikten we SSEA-1, NANOG en Oct4).</li><li> Voorzichtig twee keer Was de cellen met PBS.</li><li> Incubeer de cellen met 200 ul van secundaire antilichaam gedurende 1 uur bij kamertemperatuur, waardoor uit de buurt van licht (wij gebruikten Donkey anti-Mouse Rhodamine conjugaat en Donkey anti-Rabbit Rhodamine conjugaat).</li><li> Voorzichtig twee keer Was de cellen met PBS.</li><li> Voeg DAPI (eindconcentratie 2 ug / ml in PBS) en 10 minuten om kernen te visualiseren broeden.</li><li> Voorzichtig Was de cellen met PBS</li><li> Add anti-fade Aqua-Mount voordat beeldvorming met behulp van een omgekeerde fluorescentie microscoop.</li></ol><p class="jove_title"> 6. Alkalische fosfatase (AP) kleuring van iPS Cell Colonies</p><ol><li> IPS kolonies uit sectie 4 kan ook worden geanalyseerd voor AP-activiteit gebruik te maken van commercieel verkrijgbare kits en volgens protocol van de fabrikant.</li></ol><p class="jove_title"> Deel 7. Representatieve resultaten</p><p class="jove_content"> De Stemgent DOX Induceerbare Mouse TF lentivirus Set kan worden gebruikt om MEFs herprogrammeren naar iPS cellen. Na transductie van het MEF, expressie van transcriptiefactoren Oct4, Sox2, Klf4 en c-Myc kan worden opgespoord in cellen behandeld met doxycycline (DOX +), maar weinig of geen expressie kan worden gedetecteerd in onbehandeld (DOX-) cellen (figuur 1) . Morfologische veranderingen zal de voortgang in de tijd (12 dagen van DOX behandeling in dit voorbeeld) tot grotere, meer ES-cel-achtige kolonies met gedefinieerde kolonie randen en drie-dimensionale groei (figuur 2a) te genereren. Wanneer DOX is verwijderd, is er een merkbare terugval van cellulaire morfologie voor een aantal ES-cel-achtige kolonies, echter, veel van de koloniën handhaafden hun iPS morfologie (figuur 2a). Deze iPS kolonies, wanneer geplukt en gepasseerd, weer typisch pluripotentie marker expressie van alkalische fosfatase (AP), NANOG, Oct4 en SSEA-1 (figuur 3). Het type van de MEF cellen die worden gebruikt in dit experiment (Nanog-GFP/rtTA MEF cellen) te uiten GFP uit de endogene NANOG locus wanneer geherprogrammeerd om de pluripotentie staat. GFP expressie kan daarom gebruikt worden als een eerste indicator voor een succesvolle herprogrammering (figuur 3).</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/1447/1447fig1.jpg" alt="Figure 1" > Figuur 1:</strong> Immunocytochemie (ICC) analyse 48 uur na de DOX inductie. De uiterst links paneel (-DOX) is een vertegenwoordiger van negatieve controle voor expressie van de vier transductie factoren zonder DOX inductie. Correct uitgedrukt transcriptiefactoren werden bevestigd door overeenkomstige antilichamen (in rood), gekleurd met DAPI om de kern te visualiseren.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/1447/1447fig2.jpg" alt="Figure 2" > Figuur 2:</strong> Morfologische conversie van Nanog-GFP/rtTA MEF aan de iPS cel staat. A) 100x fase contrast beeldvorming van cellen waaruit de verdichting en omzetting van MEFs in iPS koloniën in de tijd van dag 3 (D3 + Dox) tot dag 22 (D22). DOX is ingetrokken op dag 12. Linksboven: 20x negatieve controle afbeelding van DOX-plaat. B) 200x fase-contrast en het GFP-fluorescentie beelden van de gemarkeerde dag 18 post-DOX inductie iPS kolonie. C) 200x fase-contrast en het GFP-fluorescentie beelden van de extra dag 18 post-DOX inductie iPS kolonie.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/1447/1447fig3.jpg" alt="Figure 3" > Figuur 3:</strong> Analyse van de iPS kolonies. (A) fase contrast microscopie en AP kleuren van een iPS kolonie (200x). (B) pluripotentie marker analyse: Linker paneel toont fasecontrast overlay met GFP herprogrammering reporter expressie. GFP expressie weerspiegelt de endogene NANOG expressieniveau. Middelste paneel toont ICC kleuring voor pluripotentie markers. Rechterkant van het scherm toont DAPI kleuring van de kernen (100x) te visualiseren.</p>

Discussion

Deze resultaten tonen aan dat de Stemgent DOX Induceerbare Mouse TF lentivirus Set kan worden gebruikt om efficiënt te genereren iPS kolonies door het induceren van de ectopische expressie van transcriptiefactoren getransduceerd in muis embryonale fibroblasten. Bij het ontwerpen van herprogrammering experimenten moet met een aantal variabelen worden beschouwd als de efficiëntie van de herprogrammering te optimaliseren. Ten eerste is het mogelijk om het actieve virus-to-target cel ratio (dat wil zeggen MOI) te wijzigen tijdens de primaire infectie stap te verhogen of verlagen van de transductie-efficiëntie, zulks afbreuk doet aan het aantal geïntegreerde virussen in de doelcel bevolking. Ten tweede kan het aanpassen van de lengte van tijd dat de cellen worden blootgesteld aan DOX invloed op de efficiëntie van de iPS cel kolonie generatie. Ten derde kan de proliferatieve capaciteit van de doelwitcellen invloed herprogrammering, als cellen die actief groeien en te delen zijn meer vatbaar voor herprogrammering. Ten slotte, bij de wijziging van het protocol voor de verschillende cellen nummers of verschillende grootte weefselkweek gerechten, wordt aanbevolen dat de doelcel nummers proportioneel worden aangepast aan de oppervlakte van de cultuur schotel.

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
DOX Inducible Mouse TF Concentrated Lentifirus Set		Stemgent	00-0003