प्रेरित pluripotent स्टेम सेल के चार ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर के साथ माउस भ्रूणीय Fibroblasts Reprogramming जनरेशन, डॉक्सीसाइक्लिन lentiviral transduction सिस्टम inducible

Summary

Stemgent Dox inducible माउस TF lentivirus सेट माउस भ्रूणीय fibroblasts (MEFs) प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (आईपीएस) के लिए reprogram कर सकते हैं. यहाँ हम माउस reprogramming में प्रतिलेखन Oct4 कारकों के Dox-inducible अभिव्यक्ति के लिए प्रोटोकॉल का प्रदर्शन, Sox2 Klf4, और सी Myc आईपीएस कालोनियों कि व्यक्त आम एमईएस pluripotency मार्करों उत्पन्न करने के लिए.

Abstract

प्रतिलेखन कारकों और सेल संस्कृति शर्तों के एक परिभाषित सेट का प्रयोग, Yamanaka और उनके सहयोगियों ने दिखा दिया कि retrovirus की मध्यस्थता वितरण और Oct4 की अभिव्यक्ति, Sox2, सी Myc और Klf4 माउस fibroblasts में pluripotency ^{उत्प्रेरण} के लिए सक्षम है 1 इसके बाद रिपोर्ट उपयोगिता का प्रदर्शन डॉक्सीसाइक्लिन (Dox) दोनों को प्राथमिक और माध्यमिक अन्य वयस्क माउस दैहिक सेल प्रकार की एक किस्म से आईपीएस कोशिकाओं की पीढ़ी के लिए lentiviral वितरण ^{प्रणाली} inducible 2,3.

प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (आईपीएस) आकारिकी, प्रसार, और teratoma गठन को प्रेरित करने की क्षमता में भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ते) के लिए समान हैं. सेल के दोनों प्रकार के pluripotent पुनर्योजी चिकित्सा में विभेदित कोशिकाओं या ऊतकों की पीढ़ी के लिए सामग्री शुरू करने के रूप में ^{इस्तेमाल} किया जा सकता है 4-6 आईपीएस कोशिकाओं को भी ES कोशिकाओं पर एक विशिष्ट लाभ है के रूप में वे के नैतिक दुविधा बिना ES कोशिकाओं के प्रमुख गुण एक्ज़िबिट. भ्रूण विनाश.

यहाँ हम Stemgent Dox inducible माउस TF lentivirus सेट के साथ माउस भ्रूण fibroblast कोशिकाओं (MEF) reprogramming के लिए प्रोटोकॉल का प्रदर्शन. हम यह भी दिखाना है कि Stemgent Dox inducible माउस TF lentivirus सेट MEFs में पारगमन पर चार प्रतिलेखन कारकों के प्रत्येक व्यक्त जिससे कि pluripotency ES कोशिकाओं की विशेषता मार्करों को प्रदर्शित करता है एक pluripotent स्टेम सेल राज्य उत्प्रेरण के लिए सक्षम है.

Protocol

<p class="jove_title"> 1. MEFs के वायरल transduction</p><ol><li> अपने प्रयोग, कोट 0.2% जिलेटिन बाँझ के साथ एक 15 सेमी सेल संस्कृति डिश DDH में फ़िल्टर्ड शुरुआत से पहले दिन<sub2></sub> ओ 37 पर थाली रातोंरात सेते डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ<sub2></sub>.</li><li> जिलेटिन लेपित पकवान, और बीज MEF कोशिकाओं (हम Nanog-GFP/rtTA MEF कोशिकाओं का इस्तेमाल किया) से 4×10 के घनत्व पर तरल Aspirate⁵ पकवान प्रति कोशिकाओं. MEF मध्यम विकास के 30 मिलीलीटर (450ml DMEM 50 मिलीलीटर FBS, 5 मिलीलीटर 100x गैर आवश्यक अमीनो एसिड, 5 मिलीलीटर पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, 5 मिलीलीटर 200 मिमी एल glutamine और 0.5 मिलीलीटर 55mm β-mercaptoethanol के साथ पूरक) में कोशिकाओं के लिए सेते 37 ° 5 सी और% सीओ दो दिन<sub2></sub> लगभग 80% मिला जब तक.</li><li> Aspirate मध्यम और MEF विकास केंद्रित lentivirus (4 x 100 μl वायरस शेयर + समाधान 29.6 मिलीलीटर विकास मध्यम) के साथ पूरक माध्यम के 30 मिलीलीटर जोड़ें. भी माध्यम के वितरण को सुनिश्चित करने के पकवान धीरे रॉक. सेते पर रातोंरात कोशिकाओं 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ<sub2></sub>.</li></ol><p class="jove_title"> 2. डॉक्सीसाइक्लिन प्रेरित Reprogramming</p><ol><li> 20-24 घंटे के बाद पारगमन, transduced कोशिकाओं trypsinize, 5 मिनट के लिए 200 XG पर अपकेंद्रित्र और / ES आईपीएस मध्यम विकास में resuspend (450 मिलीलीटर नॉकआउट DMEM 50ml ES सेल योग्य बछड़ा सीरम, 5 मिलीलीटर पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक, 5 मिलीलीटर 200 मिमी एल glutamine, 0.5 मिलीलीटर β mercaptoethanol और 25 μl LIF). बीज सेल संस्कृति डिश आकार के लिए एक उपयुक्त एकाग्रता में MEF transduced (हम 2.5 x 10 का इस्तेमाल किया⁵ कोशिकाओं प्रति दक्षता प्रयोगों और कॉलोनी के अलगाव के reprogramming के लिए 10 सेमी पकवान, और 2 x 10⁴ 4 आईसीसी के प्रयोगों के लिए अच्छी तरह से प्लेटों में अच्छी तरह से प्रति कोशिकाओं). 37 ° 5 सी और% सीओ पर रातोंरात सेते<sub2></sub>. नोट: किसी भी शेष transduced कोशिकाओं भविष्य के विश्लेषण के लिए तरल नाइट्रोजन में जमे हुए किया जा सकता है.</li><li> Aspirate मध्यम और ES / आईपीएस मध्यम ताजा तैयार है और डॉक्सीसाइक्लिन के साथ 2 μg / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता (हम भी Dox के बिना एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में मध्यम जोड़ी) के लिए पूरक के साथ बदलें. 37 ° 5 सी और% सीओ पर सेते<sub2></sub>.</li></ol><p class="jove_title"> 3. Transduction दक्षता Immunocytochemical विश्लेषण</p><p class="jove_content"> 48 घंटे बाद डॉक्सीसाइक्लिन प्रेरण, immunohistochemistry (आईसीसी) द्वारा पारगमन क्षमता का निर्धारण करते हैं. कैर्री बाहर 4 अच्छी तरह से प्लेटों में replated कोशिकाओं पर आईसीसी परीक्षण. निम्नलिखित प्रोटोकॉल में सूचीबद्ध सभी संस्करणों सेल संस्कृति थाली आकार के अनुसार समायोजित किया जाना चाहिए.</p><ol><li> कोशिकाओं धीरे एक बार पीबीएस के साथ (मिलीग्राम बिना धो^{2 +} + या Ca^{2 +}).</li><li> कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 0.5 मिलीलीटर पीबीएस में 4% paraformaldehyde के 500 μl के साथ कोशिकाओं को ठीक करें.</li><li> कोशिकाओं पीबीएस के साथ धीरे दो बार धो.</li><li> ठंडा 0.2% के बीच ® PBS -20 के 500 μl जोड़कर कोशिकाओं Permeabilize. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए सेते हैं.</li><li> कोशिकाओं पीबीएस के साथ धीरे दो बार धो.</li><li> कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए 200 μl अवरुद्ध बफर के साथ गैर विशिष्ट बंधनकारी ब्लॉक.</li><li> 4 में विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी के 200 μl के साथ कोशिकाओं रातोंरात सेते डिग्री सेल्सियस (हम Oct4 इस्तेमाल किया, Klf4, Sox2 और सी Myc).</li><li> कोशिकाओं पीबीएस के साथ धीरे दो बार धो.</li><li> कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के 200 μl के साथ कोशिकाओं, सेते प्रकाश से प्लेटों की रक्षा (हम गधा विरोधी खरगोश rhodamine संयुग्म इस्तेमाल किया, गधा विरोधी बकरी AlexaFluor ® संयुग्म, गधा विरोधी माउस rhodamine संयुग्म और गधा विरोधी 594 खरगोश rhodamine) संयुग्म.</li><li> कोशिकाओं पीबीएस के साथ धीरे दो बार धो.</li><li> जोड़ें DAPI (2 अंतिम एकाग्रता μg / पीबीएस में मिलीलीटर) और 10 मिनट सेते नाभिक कल्पना.</li><li> कोशिकाओं को धीरे से धो PBS के साथ.</li><li> इमेजिंग के साथ एक औंधा फ्लोरोसेंट खुर्दबीन का उपयोग करने से पहले विरोधी फीका एक्वा माउंट जोड़ें.</li></ol><p class="jove_title"> 4. अलग और विस्तार आईपीएस सेल कालोनियों</p><ol><lireprogramming प्रक्रिया की शुरुआत के बाद> (के रूप में धारा 2 में वर्णित), संस्कृतियों की निगरानी और मध्यम हर 48 घंटे की जगह. हम पहले बारह दिनों के लिए डॉक्सीसाइक्लिन युक्त मध्यम संस्कृति कोशिकाओं का इस्तेमाल किया और तब बाद में मध्यम से डॉक्सीसाइक्लिन हटा करने के लिए सुनिश्चित करें कि आईपीएस कालोनियों मैन्युअल रूप से विस्तार के लिए उठाया Dox स्वतंत्र होगा.</li><li> कक्ष reprogramming प्रक्रिया का संकेत morphological परिवर्तन के लिए दैनिक निगरानी करनी चाहिए, या जब Nanog-GFP/rtTA MEF, मॉनिटर आकारिकी और GFP प्रतिदीप्ति reprogrammed कालोनियों की पहचान की तरह कोशिकाओं का उपयोग. प्रत्येक प्रयोग अलग हो जाएगा, लेकिन कालोनियों आम तौर पर 16 और 22 दिनों के बीच अलगाव के लिए काफी बड़े हैं. इस समय सीमा के दौरान पहचान कालोनियों तो मैन्युअल रूप से अलग और विस्तार और विश्लेषण के लिए trypsinized जा सकता है.</li><li> अलग और reprogrammed कालोनियों trypsinizing पहले दिन, 5 x 10 के एक घनत्व के साथ गामा विकिरणित फीडर परत MEFs बोने से 24 अच्छी तरह से एक थाली तैयार⁴ अच्छी तरह से प्रति कोशिकाओं. 37 ° 5 सी और% सीओ पर रातोंरात सेते<sub2></sub>.</li><li> मैन्युअल रूप से प्रत्येक आईपीएस कॉलोनी लेने और सेल समुच्चय को अलग कर देना trypsinize. पुन प्लेट 24 अच्छी तरह से थाली पूर्व गामा विकिरणित फीडर परत MEFs के साथ वरीयता प्राप्त व्यक्तिगत कुओं में मध्यम / ES आईपीएस में आईपीएस कोशिकाओं. वेल्स 2 x 10 के एक घनत्व पर वरीयता प्राप्त होना चाहिए⁵ अच्छी तरह से कोशिकाओं /. 37 ° 5 सी और% सीओ पर सेते<sub2></sub>. मीडिया हर 24 घंटे बदलें.</li><li> मॉनिटर आईपीएस विकास और GFP प्रतिदीप्ति के लिए दैनिक कालोनियों. हम 6 दिनों के लिए passaging पहले हमारे संस्कृतियों को सेते हैं.</li><li> निर्धारित है जो 24 अच्छी तरह से थाली के कुओं समान GFP व्यक्त कर रहे हैं. वेल्स कि अच्छा GFP अभिव्यक्ति है और trypsinized किया जा सकता है 4 अच्छी तरह से किया गया है कि पूर्व के साथ गामा विकिरणित फीडर परत MEFs वरीयता प्राप्त प्लेटें में 01:08 passaged. ये प्लेटें आईसीसी और एपी धुंधला द्वारा pluripotent मार्कर विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.</li></ol><p class="jove_title"> 5. Pluripotency के लिए Immunocytochemical विश्लेषण</p><p class="jove_content"> हमारे आईसीसी परीक्षण 4 अच्छी तरह से प्लेटों में विस्तार कोशिकाओं पर बाहर किया गया था. निम्नलिखित प्रोटोकॉल में सूचीबद्ध सभी संस्करणों सेल संस्कृति थाली आकार के अनुसार समायोजित किया जाना चाहिए.</p><ol><li> कोशिकाओं धीरे पीबीएस के साथ दो बार (मिलीग्राम बिना धो^{2 +} + या Ca^{2 +}).</li><li> ठंडा 0.2% पीबीएस में और प्रति 10 मिनट के लिए अच्छी तरह से 20 के बीच की 0.5 मिलीलीटर में सेते हैं.</li><li> कोशिकाओं पीबीएस के साथ धीरे से तीन बार धो लें.</li><li> कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए 200 μl अवरुद्ध बफर के साथ गैर विशिष्ट बंधनकारी ब्लॉक.</li><li> 4 में विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी के 200 μl के साथ कोशिकाओं रातोंरात सेते डिग्री सेल्सियस (हम SSEA-1, Nanog और Oct4 इस्तेमाल किया).</li><li> कोशिकाओं पीबीएस के साथ धीरे दो बार धो.</li><li> कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के 200 μl के साथ कोशिकाओं, सेते प्रकाश (हम गधा विरोधी माउस rhodamine संयुग्म और गधा विरोधी खरगोश rhodamine संयुग्म इस्तेमाल) से दूर रखने के.</li><li> कोशिकाओं पीबीएस के साथ धीरे दो बार धो.</li><li> जोड़ें DAPI (2 अंतिम एकाग्रता μg / पीबीएस में मिलीलीटर) और 10 मिनट सेते नाभिक कल्पना.</li><li> कोशिकाओं को धीरे से धो PBS के साथ</li><li> इमेजिंग के साथ एक औंधा फ्लोरोसेंट खुर्दबीन का उपयोग करने से पहले विरोधी फीका एक्वा माउंट जोड़ें.</li></ol><p class="jove_title"> 6. आईपीएस सेल कालोनियों की alkaline फॉस्फेट धुंधला (एपी)</p><ol><liधारा 4 से> आईपीएस कालोनियों भी एपी गतिविधि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट के उपयोग और निर्माता प्रोटोकॉल का पालन करने के लिए विश्लेषण किया जा सकता है.</li></ol><p class="jove_title"> भाग 7. प्रतिनिधि परिणाम</p><p class="jove_content"> Stemgent Dox inducible माउस TF lentivirus सेट आईपीएस कोशिकाओं को MEFs reprogram करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. MEFs, प्रतिलेखन कारकों Oct4 की अभिव्यक्ति के पारगमन के बाद, Sox2 Klf4, और सी Myc डॉक्सीसाइक्लिन के साथ इलाज किया कोशिकाओं में पाया जा सकता है (+ Dox), लेकिन कम या कोई अभिव्यक्ति अनुपचारित (Dox) कोशिकाओं (1 आंकड़ा) में पाया जा सकता है . Morphological परिवर्तन (इस उदाहरण में Dox उपचार के 12 दिनों के) बड़ा और अधिक परिभाषित कॉलोनी किनारों और तीन आयामी विकास (2a आंकड़ा) के साथ सेल की तरह कालोनियों ES उत्पन्न पर प्रगति होगी. जब Dox निकाल दिया जाता है, वहाँ कुछ ES सेल की तरह कालोनियों के लिए सेलुलर आकारिकी की एक नजर प्रत्यावर्तन है, तथापि, कई कालोनियों के अपने आईपीएस आकारिकी (2a आंकड़ा) को बनाए रखा. इन आईपीएस कालोनियों, जब उठाया और passaged, Alkaline फॉस्फेट (एपी), Nanog, Oct4 और SSEA-1 (आंकड़ा 3) के ठेठ pluripotency मार्कर अभिव्यक्ति प्रदर्शित. MEF अंतर्जात Nanog बिन्दुपथ से इस प्रयोग (Nanog-GFP/rtTA MEF कोशिकाओं) व्यक्त GFP में इस्तेमाल किया जब pluripotency राज्य के लिए reprogrammed कोशिकाओं के प्रकार. GFP अभिव्यक्ति इसलिए सफल reprogramming (आंकड़ा 3) के लिए एक प्रारंभिक संकेत के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/1447/1447fig1.jpg" alt="Figure 1" > चित्रा 1:</strong> Immunocytochemistry विश्लेषण (आईसीसी) के 48 घंटे बाद Dox प्रेरण. दूर छोड़ दिया पैनल (Dox) Dox प्रेरण के बिना एक प्रतिनिधि चार पारगमन कारकों की अभिव्यक्ति के लिए नकारात्मक नियंत्रण है. सही ढंग से व्यक्त प्रतिलेखन कारकों इसी एंटीबॉडी (लाल रंग में दिखाया गया है), DAPI साथ दाग नाभिक कल्पना द्वारा पुष्टि की गई.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/1447/1447fig2.jpg" alt="Figure 2" > चित्रा 2:</strong> Nanog-GFP/rtTA MEFs के morphological आईपीएस कोशिका राज्य के लिए रूपांतरण. ए) 22 दिन (D22) संघनन और आईपीएस कालोनियों में MEFs के रूपांतरण (D3 Dox +) 3 दिन से समय पर प्रदर्शन कोशिकाओं के 100x चरण विपरीत इमेजिंग. Dox 12 दिन वापस ले लिया गया. ऊपरी बाईं पैनल: 20x नकारात्मक नियंत्रण छवि थाली से Dox. बी) 200x चरण विपरीत और GFP प्रतिदीप्ति छवियों प्रकाश डाला दिन के 18 प्रेरण बाद Dox आईपीएस कॉलोनी. सी) 200x चरण विपरीत और अतिरिक्त दिन के GFP प्रतिदीप्ति छवियों 18 प्रेरण बाद Dox आईपीएस कॉलोनी.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/1447/1447fig3.jpg" alt="Figure 3" > चित्रा 3:</strong> आईपीएस कालोनियों के विश्लेषण. (ए) चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी और एपी के एक आईपीएस कॉलोनी (200x) धुंधला हो जाना. (बी) pluripotency मार्कर विश्लेषण: वाम पैनल चरण GFP reprogramming संवाददाता अभिव्यक्ति के साथ इसके विपरीत उपरिशायी से पता चलता है. GFP अभिव्यक्ति अंतर्जात Nanog अभिव्यक्ति के स्तर को दर्शाता है. मध्य पैनल pluripotency मार्करों के लिए आईसीसी धुंधला से पता चलता है. राइट पैनल DAPI नाभिक (100x) कल्पना धुंधला हो जाना दिखाता है.</p>

Discussion

इन परिणामों दिखाना है कि Stemgent Dox inducible माउस TF lentivirus सेट करने के लिए कुशलतापूर्वक के अस्थानिक अभिव्यक्ति उत्प्रेरण द्वारा आईपीएस कालोनियों को उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है माउस भ्रूणीय fibroblasts में प्रतिलेखन कारकों transduced. जब reprogramming प्रयोगों डिजाइन, कई चर reprogramming की दक्षता का अनुकूलन करने के लिए विचार किया जाना चाहिए. सबसे पहले, यह संभव है को बढ़ाने या पारगमन दक्षता में कमी, जिससे लक्ष्य सेल की आबादी में एकीकृत वायरस की संख्या को प्रभावित प्राथमिक संक्रमण चरण के दौरान सक्रिय कक्ष वायरस लक्ष्य अनुपात (यानी MOI) को संशोधित. दूसरा, कोशिकाओं Dox उजागर कर रहे हैं समय की लंबाई का समायोजन आईपीएस सेल कॉलोनी पीढ़ी की दक्षता को प्रभावित कर सकते हैं. तीसरा, reprogramming लक्ष्य कोशिकाओं की proliferative क्षमता प्रभाव, के रूप में कोशिकाओं जो सक्रिय रूप से बढ़ रहे हैं और विभाजित अधिक reprogramming करने के लिए उत्तरदायी हैं कर सकते हैं. अंत में, जब अलग सेल नंबर या अलग आकार ऊतक संस्कृति व्यंजन के लिए प्रोटोकॉल को संशोधित, यह अनुशंसा की जाती है कि लक्ष्य कक्ष संख्या आनुपातिक संस्कृति डिश की सतह क्षेत्र के लिए समायोजित किया जा.

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
DOX Inducible Mouse TF Concentrated Lentifirus Set		Stemgent	00-0003