Geração de células-tronco pluripotentes induzidas pela reprogramação fibroblastos de rato embrionárias com um fator de transcrição Quatro, Doxiciclina induzível Sistema de Transdução Lentivirus

Summary

O Stemgent induzível Dox Mouse Set Lentivirus TF pode reprogramar fibroblastos embrionárias de camundongos (MEFs) para pluripotentes induzidas da haste (iPS) células. Aqui demonstramos o protocolo para DOX induzível-expressão de fatores de reprogramação em ratos transcrição Oct4, Sox2, KLF4 e c-Myc para gerar colônias iPS que expressam marcadores comuns MES pluripotência.

Abstract

Usando um conjunto definido de fatores de transcrição e as condições de cultura de células, Yamanaka e seus colegas demonstraram que retrovírus mediada entrega e expressão de Oct4, Sox2, c-Myc e KLF4 é capaz de induzir pluripotência em fibroblastos de rato ^1. Relatórios subseqüentes têm demonstrado a utilidade da doxiciclina (DOX) induzível sistema de entrega lentiviral para a geração de células primárias e secundárias iPS a partir de uma variedade de outros adultos do mouse tipos de células somáticas ^2,3.

Pluripotentes induzidas da haste (iPS) são semelhantes às células-tronco embrionárias (ES) células em proliferação, morfologia e capacidade de induzir a formação de teratoma. Ambos os tipos de célula podem ser usados ​​como material de partida para pluripotentes a geração de células diferenciadas ou tecidos em medicina regenerativa. ^4-6 células iPS também têm uma vantagem distinta sobre células-tronco embrionárias como eles apresentam propriedades-chave das células-tronco embrionárias sem o dilema ético de destruição de embriões.

Aqui demonstramos o protocolo para a reprogramação embrionárias de rato de fibroblastos (MEF), as células com o induzível DOX Stemgent Set rato TF Lentivirus. Nós também demonstramos que a Stemgent induzível DOX Mouse Set Lentivirus TF é capaz de expressar cada um dos quatro fatores de transcrição em cima de transdução em MEFs induzindo um estado de células-tronco pluripotentes que exibe os marcadores de pluripotência característica de células ES.

Protocol

<p class="jove_title"> 1. Transdução viral de MEFs</p><ol><li> O dia antes de começar sua experiência, o revestimento de um prato de 15 centímetros de cultura celular com 0,2% de gelatina estéril filtrado em DDH₂ O. Incubar a placa durante a noite a 37 ° C e 5% CO₂.</li><li> Aspirar o líquido do prato de gelatina revestidos, e células de semente MEF (usamos células Nanog-GFP/rtTA MEF) a uma densidade de 4×10⁵ Células por prato. Incubar as células em 30 ml de meio de crescimento MEF (450ml DMEM suplementado com 50 ml FBS, 5 ml 100x não-aminoácidos essenciais, 5 ml de penicilina / estreptomicina, 5 ml 200 mM L-glutamina e 0,5 ml 55mm β-mercaptoetanol) para dois dias a 37 ° CO C e 5%₂ Até aproximadamente 80% confluentes.</li><li> Aspirar o meio e adicione 30 ml de MEF meio de crescimento suplementado com lentivírus concentrado (4 x 100 mL de solução stock de vírus + 29,6 ml meio de crescimento). Rocha o prato com cuidado para assegurar uma distribuição uniforme do médium. Incubar as células durante a noite a 37 ° C e 5% CO₂.</li></ol><p class="jove_title"> 2. Doxiciclina Induzida Reprogramação</p><ol><li> 20-24 horas pós-transdução, as células trypsinize transduzidas, centrifugar a 200 xg por 5 minutos e ressuspender em ES / iPS meio de crescimento (450 ml Knockout DMEM suplementado com 50ml de células ES-qualificados soro bovino, 5 ml de penicilina / estreptomicina, 5 ml 200 mM L-glutamina, 0,5 ml β-mercaptoetanol e 25 mL LIF). Semente transduzidas MEF em uma concentração adequada para o tamanho do prato de cultura de células (usamos 2,5 x 10⁵ Células por 10 centímetros prato para a reprogramação experimentos de eficiência e isolamento da colônia, e 2 x 10⁴ Células por poço em 4 pratos bem para experimentos ICC). Incubar overnight a 37 ° CO C e 5%₂. Nota: as células restantes transduzidas podem ser congelados em nitrogênio líquido para análise futura.</li><li> Aspirar a médio e substituir com ES / iPS meio preparado fresco e suplementadas com doxiciclina para uma concentração final de 2 mg / ml (nós também acrescentou meio sem DOX como controle negativo). Incubar a 37 ° CO C e 5%₂.</li></ol><p class="jove_title"> 3. Análise imunocitoquímica de Eficiência Transdução</p><p class="jove_content"> 48 horas pós-indução de doxiciclina, determinar a eficiência de transdução por imuno-histoquímica (ICC). Realizar testes de ICC em células replated em 4 pratos bem. Todos os volumes listados na seguinte protocolo deverá ser ajustada de acordo com o tamanho da placa de cultura de células.</p><ol><li> Lavar as células com cuidado uma vez com PBS (sem Mg^{2 +} + Ou Ca^{2 +}).</li><li> Fixar as células com 500 mL de 0,5 ml de paraformaldeído 4% em PBS por 15 minutos em temperatura ambiente.</li><li> Lave suavemente as células duas vezes com PBS.</li><li> Permeabilizar as células, adicionando 500 mL de gelada 0,2% Tween ® -20 em PBS. Incubar por 10 minutos em temperatura ambiente.</li><li> Lave suavemente as células duas vezes com PBS.</li><li> Bloco de ligação não específica com 200 mL de buffer de bloqueio para uma hora em temperatura ambiente.</li><li> Incubar as células com 200 mL do anticorpo primário específico durante a noite a 4 ° C (usamos Oct4, KLF4, Sox2 e c-Myc).</li><li> Lave suavemente as células duas vezes com PBS.</li><li> Incubar as células com 200 mL de anticorpo secundário por 1 hora à temperatura ambiente, proteger as placas da luz (usamos Donkey Rodamina conjugado anti-coelho, Donkey Goat anti-AlexaFluor ® 594 conjugado, Donkey anti-Mouse Rodamina conjugado e Donkey anti -Coelho Rodamina conjugado).</li><li> Lave suavemente as células duas vezes com PBS.</li><li> Adicionar DAPI (concentração final 2 mg / ml em PBS) e incubar 10 minutos para visualizar núcleos.</li><li> Lave suavemente as células com PBS.</li><li> Adicionar anti-fade Aqua-Mount antes de imagem usando um microscópio invertido de fluorescência.</li></ol><p class="jove_title"> 4. Isolar e expandir colônias iPS celular</p><ol><li> Depois de iniciar o processo de reprogramação (como descrito na seção 2), monitor e substituir as culturas de médio a cada 48 horas. Usamos doxiciclina meio contendo as células de cultura para os primeiros 12 dias e posteriormente removido doxiciclina do meio para garantir que as colônias iPS manualmente escolhido para expansão seria DOX independentes.</li><li> As células devem ser monitorados diariamente por mudanças morfológicas indicativas do processo de reprogramação, ou quando se utiliza células como Nanog-GFP/rtTA MEF, monitor morfologia e fluorescência da GFP para identificar colônias reprogramada. Cada experimento será diferente, mas as colônias são geralmente grandes o suficiente para o isolamento entre os 16 e 22 dias. Colônias identificadas durante este período de tempo pode ser manualmente isolada e tripsinizados para a expansão e análise.</li><li> No dia antes de isolar as colônias e trypsinizing reprogramado, prepare uma placa de 24 poços de semeadura com gama-irradiados feeder layer MEFs a uma densidade de 5 x 10⁴ Células por poço. Incubar overnight a 37 ° CO C e 5%₂.</li><li> Manualmente escolher cada colônia iPS e trypsinize dissociar os agregados celulares. Re-plate as células iPS na ES / iPS meio em poços individuais da placa de 24 poços de pré-semeados com gama-irradiados feeder layer MEFs. Poços devem ser semeadas a uma densidade de 2 x 10⁵ Células / poço. Incubar a 37 ° CO C e 5%₂. Mudança de mídia a cada 24 horas.</li><li> Colônias monitor iPS diariamente para o crescimento e fluorescência da GFP. Nós incubar nossas culturas por 6 dias antes passaging.</li><li> Determinar que os poços da placa de 24 poços são uniformemente expressando GFP. Poços que têm expressão GFP bom pode ser tripsinizados e várias passagens 01:08 em 4 bem-placas que foram pré-semeados com gama-irradiados feeder layer MEFs. Estas placas podem ser usadas para a análise do marcador pluripotentes por ICC e coloração AP.</li></ol><p class="jove_title"> 5. Análise imunocitoquímica de pluripotência</p><p class="jove_content"> Nossos testes ICC foi realizada em células expandidas em 4 pratos bem. Todos os volumes listados na seguinte protocolo deverá ser ajustada de acordo com o tamanho da placa de cultura de células.</p><ol><li> Lave suavemente as células duas vezes com PBS (sem Mg^{2 +} + Ou Ca^{2 +}).</li><li> Incubar em 0,5 ml de gelado 0,2% Tween 20 em PBS por poço por 10 minutos.</li><li> Lave suavemente as células três vezes com PBS.</li><li> Bloco de ligação não específica com 200 mL de buffer de bloqueio para uma hora em temperatura ambiente.</li><li> Incubar as células com 200 mL do anticorpo primário específico durante a noite a 4 ° C (usamos SSEA-1, Nanog e Oct4).</li><li> Lave suavemente as células duas vezes com PBS.</li><li> Incubar as células com 200 mL de anticorpo secundário por 1 hora à temperatura ambiente, mantendo-se longe da luz (usamos Donkey anti-Mouse Rodamina conjugado e Donkey Rodamina conjugado anti-coelho).</li><li> Lave suavemente as células duas vezes com PBS.</li><li> Adicionar DAPI (concentração final 2 mg / ml em PBS) e incubar 10 minutos para visualizar núcleos.</li><li> Lave suavemente as células com PBS</li><li> Adicionar anti-fade Aqua-Mount antes de imagem usando um microscópio invertido de fluorescência.</li></ol><p class="jove_title"> 6. Fosfatase alcalina de coloração (AP) de colônias de células iPS</p><ol><li> IPS colônias da seção 4 também podem ser analisadas para a atividade AP utilizando kits comercialmente disponíveis e seguindo o protocolo do fabricante.</li></ol><p class="jove_title"> Parte 7. Resultados representante</p><p class="jove_content"> O Stemgent induzível DOX Mouse Set Lentivirus TF pode ser usado para reprogramar as células iPS MEFs. Depois de transdução do MEFs, expressão de fatores de transcrição Oct4, Sox2, KLF4 e c-Myc pode ser detectada em células tratadas com doxiciclina (DOX +), mas pouca expressão ou não pode ser detectado em não tratada (DOX) células (figura 1) . Alterações morfológicas vai progredir ao longo do tempo (12 dias de tratamento DOX neste exemplo) para gerar ES maiores, mais semelhantes a células colônias com bordas definidas e três colônias de crescimento dimensional (figura 2a). Quando DOX é removido, há uma reversão notável da morfologia celular para alguns ES celular-como colônias, no entanto, muitas das colônias mantiveram a sua morfologia iPS (figura 2a). Estas colônias iPS, quando escolhido e várias passagens, display expressão do marcador típico pluripotência de fosfatase alcalina (AP), Nanog, Oct4 e SSEA-1 (figura 3). O tipo de células MEF utilizadas neste experimento (células Nanog-GFP/rtTA MEF) expressam GFP do lócus Nanog endógena quando reprogramado para o estado de pluripotência. Expressão GFP pode, portanto, ser usado como um indicador preliminar para a reprogramação de sucesso (figura 3).</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/1447/1447fig1.jpg" alt="Figure 1" > Figura 1:</strong> Análise imunocitoquímica (ICC) 48 horas pós-indução DOX. O painel à esquerda (-DOX) é um controle negativo representante para a expressão dos quatro fatores de transdução sem indução DOX. Fatores de transcrição expressado corretamente foram confirmados por meio de anticorpos correspondente (mostrada em vermelho), coradas com DAPI para visualizar o núcleo.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/1447/1447fig2.jpg" alt="Figure 2" > Figura 2:</strong> Conversão morfológica de Nanog-GFP/rtTA MEFs ao estado de células iPS. A) imagem de contraste de fase 100x de células demonstrando a compactação e conversão de MEFs em colônias iPS ao longo do tempo a partir de dia 3 (D3 + Dox) para dia 22 (D22). DOX foi retirado no dia 12. Painel esquerdo superior: 20x controle de imagem negativa de-DOX prato. B) 200x de contraste de fase e as imagens de fluorescência da GFP destaque do dia 18 pós-indução DOX colônia iPS. C) 200x de contraste de fase e as imagens de fluorescência da GFP do dia adicional de 18 pós-indução DOX colônia iPS.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/1447/1447fig3.jpg" alt="Figure 3" > Figura 3:</strong> Análise de colônias de iPS. (A) A microscopia de contraste de fase e AP coloração de uma colônia iPS (200x). (B) análise de marcador de pluripotência: painel da esquerda mostra overlay de contraste de fase com expressão GFP repórter reprogramação. Expressão GFP reflete o nível de expressão endógena Nanog. Painel do meio mostra ICC coloração para marcadores pluripotência. Painel da direita apresenta coloração DAPI para visualizar os núcleos (100x).</p>

Discussion

Estes resultados demonstram que a Stemgent DOX induzível Mouse Set Lentivirus TF pode ser usado para gerar de forma eficiente iPS colônias por induzir a expressão ectópica de transduzidas fatores de transcrição em fibroblastos do ratinho embrionárias. Ao projetar experimentos reprogramação, diversas variáveis ​​devem ser considerados para otimizar a eficiência de reprogramação. Primeiro, é possível modificar a relação célula ativa do vírus em relação ao objectivo (ie MOI) durante a etapa de infecção primária para aumentar ou diminuir a eficiência de transdução, afectando assim o número de vírus integrado na população celular alvo. Segundo, ajustando o tempo de as células são expostas a DOX pode afetar a eficiência de geração de iPS colônia de células. Terceiro, a capacidade proliferativa das células-alvo pode ter impacto reprogramação, as células que estão crescendo ativamente e dividindo são mais passíveis de reprogramação. Por último, ao modificar o protocolo de número de células diferentes ou diferentes tamanho pratos de cultura de tecido, é recomendado que os números de célula-alvo ser ajustado proporcionalmente à área da superfície da placa de cultura.

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
DOX Inducible Mouse TF Concentrated Lentifirus Set		Stemgent	00-0003