В пробирке FluoroBlok опухолевой инвазии Пробирной

Summary

В этом видеоролике показано, как измерить ячейки вторжения через клеточные культуры вставками использованием флуоресценции основе методологии.

Abstract

Отличительной чертой метастатических клеток является их способность к вторжению через базальную мембрану и мигрировать в другие части тела. Клетки должны быть в состоянии и выделяют протеазы, которые расщепляют базальной мембраны, а также миграцию, чтобы быть агрессивным. BD BioCoat опухолевой инвазии Система обеспечивает клетки с условиями, которые позволяют оценить их инвазивных собственности<em> В пробирке</em^1,2. Она состоит из BD Сокол FluoroBlok 24-многоямного Вставить Тарелка с 8,0 микрон размер пор мембраны ПЭТ, которая была равномерно покрыта BD Матригель Matrix. Этот равномерный слой BD Матригель Матрица служит восстановленный базальной мембраны<em> В пробирке</em> Предоставление истинной барьер для неинвазивного клетки, представляя соответствующую структуру белка для изучения вторжения. Покрытие процесс закрывает поры мембраны, блокируя неинвазивных клетки мигрируют через мембрану. В отличие от инвазивных клетки способны отделяться от и мигрируют через покрытые оболочкой. Количественный клеточного вторжения может быть достигнуто либо пре-и пост-клеточного вторжения маркировки с флуоресцентным красителем, таких как DiIC₁₂ (3) или кальцеин AM, соответственно, и измерения флуоресценции вторжения в клетки. Так как мембрана BD FluoroBlok эффективно блокирует прохождение света от 490-700 нм при> 99% эффективности, флуоресцентно-меченых клеток, которые еще не вторглась не обнаруживаются снизу чтения флуоресценции читателя пластины. Однако клетки, которые вторглись на нижней мембраны уже не защищены от источника света и обнаружил с соответствующим читатель пластины. Это видео демонстрирует вторжения конечной точкой анализа клеточной, используя кальцеин утра до обнаружения вторжения клеток.

Protocol

После маркировки и измерения с использованием BD кальцеин AM флуоресцентного красителя Клетки помечены для количественного после того как они вторглись через BD Матригель Матрицы и пропускается через мембраны BD FluoroBlok. В результате, только конечная точка измерения клеточного вторжения могут быть получены. Расти клетки ~ 80% слияния. Подготовка и увлажняет вставить системе. Удалите пакет от -20 ° C хранения и дайте ему прийти к комнатной температуре. Открытый пакет фольги и добавить 500 мкл теплой (37 ° C) СМИ интерьера вставки скважин. Разрешить пластину увлажняет в течение 2 часов при температуре 37 ° C, 5% СО 2. Примечание: нет необходимости увлажняет немелованной BD Сокол FluoroBlok 24-многоямного Вставьте системы, которая будет использоваться в качестве контроля миграции клеток. После регидратации, осторожно удалите среды от вставки скважин, не нарушая слой BD Матригель Матрица на мембране. Система готова к использованию. Подготовка клеточные суспензии по trypsinizing ячейки монослоев и ресуспендирования клеток в бессывороточной DMEM на 5 х 10 4 клеток / мл. Примечание: Если вы используете другой тип клеток необходимо определить оптимальную плотность посева. Для определения оптимальной плотности посева для вашего типа клеток на пористой поверхности роста, использование диапазона плотности посева (клеток / см 2), что скобки плотности посева используются на непористых поверхностях (например, фляги, блюда и тарелки). Например, если вы в настоящее время семена на уровне 2,5 х 10 5 клеток / см 2, семян при различных концентрациях между ячейками 5 × 10 4 и 5 х 10 5 клеток / см 2 для определения оптимальной начальной плотности посева. Добавить 500 мкл клеточной суспензии (2,5 х 10 4 клеток) в апикальной камер. Добавить 750 мкл хемоаттрактант (5% ЭТС в DMEM) к каждому из базального камеры, используя образец порты для доступа. Инкубируйте опухоли BD BioCoat системы Вторжение и немелованной BD Сокол FluoroBlok 24-многоямного Вставьте пластины на 20-22 часов при 37 ° C, 5% СО 2 атмосферы. После инкубации, осторожно удалите среды от апикальной камер. Это может быть достигнуто, вытряхнув содержимое в контейнер для отходов. Не прикасайтесь к нижней поверхности вставки системы. Передача вставить системы во второй 24-луночного планшета, содержащую 500 мкл / лунку 4 мкг / мл кальцеин AM в HBSS. Инкубируйте в течение 1 часа при температуре 37 ° C, 5% СО 2. Решение кальцеин AM не удаляется из нижней палаты, прежде чем читать флуоресценции, потому что это жизненно nonfluorescent краситель, который превращается в зеленого флуоресцентного кальцеин по цитозольного эстераз. Флуоресценция вторглись в клетках читается на длинах волн 494/517 нм (Ex / Ет) на дно чтения читатель флуоресцентные пластины. Установка усиления, возможно, должны быть определены эмпирически, но середина усиления должна быть достаточной отправной точкой. Установка усиления, что слишком высокая может привести к насыщению детектор с высокой флуоресцентные пробы; это может помешать приобретению значимых результатов. Использование AutoGain (если поддерживается вашим читателем) не рекомендуется. Перевернутой флуоресцентного микроскопа может быть использована для проверки ваших результатов, это особенно полезно, чтобы сделать это в первый раз вы запустите этот анализ. Примечание: Крайне важно, чтобы Вставить системы можно прочитать с помощью правильную карту пластины. Для получения информации о загрузке карты пластины видеть BD Технический бюллетень № 436 от www.bdbiosciences.com или свяжитесь с BD Техническая поддержка (labware@bd.com). Правильная ориентация пластина с хорошо A1 в левом верхнем углу и логотип BD Флакон ориентированных на право, как пластина вставляется в считыватель. Сжатие данных Данные выражается в следующей формуле: Фон может быть вычтен до расчета процентов вторжение ячейки РФС = относительная флуоресцентные единиц.

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
BD BioCoat Tumor Invasion System		BD Biosciences	354165 or 354166
HT-1080 and NIH/3T3 cells		ATCC
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM; serum-free)
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, without calcium and magnesium (DPBS)
BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Insert System to be used as a cell migration control		BD Biosciences	351157 or 351158
5% Fetal Bovine Serum in DMEM
BD Calcein AM Fluorescent Dye		BD Biosciences	354216 or 354217
Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS)
BD Falcon 24-well plates for post cell invasion labeling		BD Biosciences	351147
Fluorescence plate reader with bottom reading capabilities		PerkinElmer EnVision (R), TECAN Infinite (R), Molecular Devices SpectraMax (R), BioTek Synergy (TM), BMG LABTECH PHERAstar.