Bir In vitro FluoroBlok Tümör Invasion Testi
Summary
Bu video ile hücre işgali bir floresan tabanlı bir metodoloji kullanarak hücre kültürü ekler nasıl ölçüleceğini gösteriyor.
Abstract
Damgasını metastatik hücreler bazal membran ile istila ve vücudun diğer bölgelerine göç etmek yeteneğine sahip olmalarıdır. Hücreler, invaziv olması için bazal membran parçalayan yanı sıra göç hem salgılar proteazlar gerekir. BD BioCoat Tümör Invasion Sistem kendi invaziv mülkiyet değerlendirilmesine olanak koşulları ile hücreleri sağlar.<em> In vitro</em<sup> 1,2</sup>. BD Falcon FluoroBlok 24-multiwell düzgün BD Matrigel Matrix ile kaplanmış bir 8.0 mikron gözenek boyutu PET membran Ekle Plaka oluşur. Bu tek tip BD Matrigel Matrix katmanı sulandırılmış bir bazal membran olarak hizmet vermektedir<em> In vitro</emIşgali çalışma için uygun bir protein yapısı sunarken> non-invaziv hücreler gerçek bir bariyer sağlar. Kaplama işlemi, non-invaziv hücre zarından göç engelleme, membran gözenekleri tıkar. Buna karşılık, invaziv hücreler kendilerini ayırmak ve kaplamalı zarından göç etmek mümkün. Hücre işgali kantitasyonu ya önceden ya da post-hücre işgali etiketleme gibi DiIC olarak floresan boya ile elde edilebilir<sub> 12</sub> (3) veya Calcein sırasıyla, AM ve ölçüm hücreleri istila floresan. BD FluoroBlok membran etkin>% 99 oranında verim 490-700 nm ışık geçişini engeller, floresan etiketli işgal değil hücrelerin bir alt okuma floresan plaka okuyucu tarafından algılanmaz. Ancak, membran alt işgal hücrelerin ışık kaynağı korumalı artık ve ilgili plaka okuyucu ile tespit edilir. Bu video Calcein işgal hücreleri tespit AM kullanarak, bir son nokta hücre işgali tahlil göstermektedir.
Protocol
BD Calcein kullanarak Post-etiketleme ve ölçüm Floresan Boya Hücreler, BD Matrigel Matrix aracılığıyla işgal ve BD FluoroBlok zarından geçtikten sonra kantitatif için etiketlenir. Sonuç olarak, hücre işgalinin sadece uç nokta ölçümü elde edilebilir. ~ 80% izdiham hücrelerin büyümesine. Hazırlayın ve ekleme sistemi rehidrate. -20 ° C depolama paketi çıkartın ve oda sıcaklığına gelmesine izin. Folyo paketi açın ve ekleme kuyu iç 500 mcL sıcak (37 ° C) medya ekleyin. İzin plaka 37 az 2 saat rehidrate ° C, 5% CO 2. Not: kaplanmamış BD Falcon FluoroBlok bir hücre göçü kontrol olarak kullanılan 24-multiwell Ekle Sistemi rehidrate için gerekli değildir. Rehidrasyon sonra, membran BD Matrigel Matrix katmanı bozmadan özenle ekleme kuyulardan orta kaldırmak. Sistemi artık kullanıma hazırdır. Hücre mono tabakaları trypsinizing ve 5 x 10 4 hücre / ml serum serbest DMEM hücreleri resuspending hücre süspansiyonları hazırlayın. Not: Eğer farklı bir hücre tipi kullanıyorsanız, en uygun ekim yoğunluğu belirlemek gerekir. , Gözenekli bir büyüme yüzey üzerinde hücre tipi için en uygun ekim yoğunluğu belirlemek için bir dizi ekim yoğunlukları (hücre / cm 2) parantez gözeneksiz yüzeylerde kullanılan tohum yoğunluğu (yani matara, yemekler ve plakalar) . Örneğin, çeşitli hücre konsantrasyonlarda arasında 2.5 x 10 5 hücre / cm 2, tohum henüz tohum 5 x 10 4 ve 5 x 10 5 hücre / cm 2 optimal ilk tohumlama yoğunluğunu belirlemek için. Apikal odalarına hücre süspansiyonu (2.5 x 10 4 hücre) 500 mcL ekleyin. Erişim için örnek bağlantı noktalarını kullanarak, bazal odalarının her biri 750 mcL kemoatraktan (DMEM içinde% 5 FBS) ekleyin. BD BioCoat Tümör Invasion Sistemi ve kaplanmamış BD Falcon FluoroBlok, 37 ° C'de% 5 CO 2 atmosfer 20-22 saat süreyle 24-multiwell Ekle Plaka inkübe edin . Inkübasyon sonrasında dikkatle apikal odalarından orta çıkarın. Bu, bir atık kabı içine içeriğini Flicking tarafından yapılabilir. Ekleme sistemi alt yüzeyine dokunmayın. / Iyi 4 mikrogram / ml Calcein PM HBSS içinde 500 mcL içeren ikinci bir 24 plaka ekleme sistemi aktarın. 1 saat 37 ° ° C'de,% 5 CO 2. Sitozolik esterazlar yeşil flüoresan Calcein dönüştürülür nonfluorescent hayati boya çünkü Calcein AM çözüm floresan okumadan önce alt kamara kaldırılmaz. Işgal hücreleri Floresans bir alt okuma floresan plak okuyucu (Ex / Em) 494/517 nm dalga boylarında okunur. Kazanç ayarı ampirik olarak tespit edilmesi gerekebilir, ancak bir orta nokta kazancı yeterli bir başlangıç noktası olmalıdır. Çok yüksek bir kazanç ayarı yüksek floresan örneği ile dedektör doygunluk yol açabilir, bu anlamlı sonuçlar elde önleyebilir. Autogain (okuyucu desteklenmesi halinde) kullanımı tavsiye edilmez. Ters bir floresan mikroskop sonuçları doğrulamak için kullanılabilir; bu testte ilk kez çalıştırdığınızda yapmak için özellikle yararlı. Not: Ekle Sistemleri doğru plaka haritası kullanılarak okunur olduğunu büyük önem taşımaktadır. Www.bdbiosciences.com veya iletişim BD Teknik Destek (labware@bd.com) BD Teknik Bülten No 436 yükleme plakası haritalar hakkında daha fazla bilgi için bkz. Plaka okuyucu eklenir Uygun plaka yönü sağa yönelik sol üst köşesinde ve BD Flakon logosu A1 kuyusunda. Veri İndirgeme Veri aşağıdaki denklemle ifade edilir: Arka Plan hesaplama yüzde hücre işgali öncesinde çıkarılmalıdır RFU = göreceli floresan birimleri.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| BD BioCoat Tumor Invasion System | BD Biosciences | 354165 or 354166 | ||
| HT-1080 and NIH/3T3 cells | ATCC | |||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM; serum-free) | ||||
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, without calcium and magnesium (DPBS) | ||||
| BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Insert System to be used as a cell migration control | BD Biosciences | 351157 or 351158 | ||
| 5% Fetal Bovine Serum in DMEM | ||||
| BD Calcein AM Fluorescent Dye | BD Biosciences | 354216 or 354217 | ||
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | ||||
| BD Falcon 24-well plates for post cell invasion labeling | BD Biosciences | 351147 | ||
| Fluorescence plate reader with bottom reading capabilities | PerkinElmer EnVision (R), TECAN Infinite (R), Molecular Devices SpectraMax (R), BioTek Synergy (TM), BMG LABTECH PHERAstar. |
Referências
- Sethi, G., Ahn, K. S., Pandey, M. K., Aggarwal, B. B. Celastrol, a novel triterpene, potentiates TNF-induced apoptosis and suppresses invasion of tumor cells by inhibiting NF-κB-regulated gene products and TAK1-mediated NF-ΚB activation. Blood. 109, 2727-2735 (2007).
- Takada, Y., Kobayashi, Y., Aggarwal, B. B. Evodiamine Aboloishes Constitutive and Inducible NF-κB Activation by Inhibiting IκBα Kinase Activation, Thereby Suppressing NF-κB-regulated Antiapoptotic and Metastatic Gene Expression, Up-regulating Apoptosis, and Inhibiting Invasion. J. Biol. Chem. 280, 17203-17212 (2005).
- Harikumar, K. B., Kunnumakkara, A. B., Ahn, K. S., Anand, P., Krishnan, S., Guha, S., Aggarwal, B. B. Modification of the cysteini residues in IκBα kinase and NF-κB (p65) by xanthohumol leads to suppression of NF-κB-regulated gene products and potentiation of apoptosis in leukemia cells. Blood. , 113-2003 (2009).
- Nair, A. S., Sishodia, S., Ahn, K. S., Kunnumakkara, A. B., Sethi, G., Aggarwal, B. B. D. e. g. u. e. l. i. n. an Akt Inhibitor, Suppresses IΚBα Kinase Activation Leading to Suppression of NF-κB-Regulated Gene Expression, Potentiation of Apoptosis, and Inhibition of Cellular Invasion. J. Immunol. , 177-5612 (2006).
- Partridge, J., Qian, S. Quantitative and High-Throughput Screening of Tumor Cell Invasion using a Cell-based Model. Society for Biomolecular Screening 2005 Conference. , (2005).
- Mannuzza, F., Flaherty, P., Ilsley, S., Kramer, M. An Improved In Vitro Device For Measuring Cell Invasion and Method for its Formation. US patent. , (2004).
- Flaherty, P., Goldberger, A., Dery, O. Effect of Fluorescent Cell Labeling on Tumor Invasion and Screening of Anti-Metastatic Compounds. Mole. Biol. Cell. 12, 46a-46a (2001).
- Flaherty, P., Mannuzza, F., Ilsley, S., Maliakal, J., Wu, M. Screening of Anti-Metastatic Compounds by a Fluorescence Based Tumor Invasion Assay. Screentech 2001 Conference. , (2005).
- Mannuzza, F., Flaherty, P., Wu, M., Ilsley, S. Development of a Quantitative, High-Throughput Assay System for the Discovery of Anti-Cancer Drugs. Proceedings of the Society for Biomolecular Screening. , (1999).
Tags
In Vitro FluoroBlok Tumor Invasion AssayMetastatic CellsBasement MembraneMigrateInvasive PropertyBD BioCoat Tumor Invasion SystemBD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Insert Plate8.0 Micron Pore Size PET MembraneBD Matrigel MatrixReconstituted Basement MembraneProtein StructureInvasion StudyCell Invasion QuantitationFluorescent Dye LabelingDiIC12(3)Calcein AMFluorescence MeasurementBD FluoroBlok Membrane
Citar este artigo
Partridge, J., Flaherty, P. An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay. J. Vis. Exp. (29), e1475, doi:10.3791/1475 (2009).