Desnaturação uréia eletroforese em gel de poliacrilamida é usado para separar single-stranded DNA ou RNA até um limite de 500 nucleotídeos. Uréia em combinação com amostras de calor desnatura e não estruturadas cadeias simples migrar dentro da matriz de gel de acordo com seu peso molecular.
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Artigo de método
Desnaturação Uréia Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (PAGE Urea)
Neste artigo
Resumo
Resumo
PAGE desnaturante uréia ou uréia eletroforese em gel de poliacrilamida emprega 6-8 M de uréia, que desnatura DNA secundário ou estruturas de RNA e é usado para a sua separação em uma matriz de gel de poliacrilamida com base no peso molecular. Fragmentos de 2 a 500 bases, com diferenças de comprimento tão pequeno quanto um único nucleotídeo, podem ser separados utilizando este método 1. A migração da amostra é dependente da concentração de acrilamida escolhido. A maior porcentagem de poliacrilamida resolve fragmentos menor peso molecular. A combinação de uréia e temperaturas de 45-55 ° C durante a execução gel permite a separação de DNA não estruturados ou moléculas de RNA.
Em geral, este método é necessário para analisar ou purificar DNA de fita simples ou fragmentos de RNA, tais como oligonucleotídeos sintetizados ou rotulados ou produtos a partir de reações de clivagem enzimática.
Neste artigo de vídeo vamos mostrar como preparar e executar o gel de poliacrilamida desnaturante uréia. Dicas técnicas estão incluídos, além dos 1,2 protocolo original.
Protocolo
O protocolo de texto completo e detalhado para este procedimento experimental está disponível em protocolos atuais em Biologia Molecular. Detalhadas passo-a-passo as instruções para a montagem do sanduíche de gel e gel para os aparelhos podem ser encontrados no site da BioRad 3.
Equipamentos necessários:
Placas de vidro (interno e externo)
10 células cm: 10,1 x 7.3 cm (placa interna), 10,1 x 8,2 cm (placa externa), BioRad
20 celulares cm: 20 x 20 cm (placa interna), 20 x 22,3 cm (placa externa), BioRad
0,5-1,5 mm comb gel e espaçadores
Gel ficar fundição
Aparelho de gel com tampa e cabo....
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Discussão
- A nitidez da banda depende de vários fatores. O volume da amostra carregada para as bandas nítidas deve ser o menor possível, isto é, idealmente entre 1-5 mL. No entanto, até 15 mL podem ser carregados que ainda garante uma resolução aceitável. Resultados menos amostra de volume em faixas mais nítidas.
- A qualidade da banda é também dependente da espessura do gel. Géis mais finas, como 0,75 milímetro mostram melhores resultados do que 1,5 milímetros de espessura géis.
- A forma de bandas também pode ser influenciado du.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a declarar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pela Academic Singapura Research Council (ARC) [número de concessão 90/07]. Agradecemos pelo apoio radiodurans.
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Referências
- Maniatis, T., Jeffrey, A., van deSande, H. Chain length determination of small double- and single-stranded DNA molecules by polyacrylamide gel electrophoresis. Biochemistry. 14, 3787-3794 (1975).
- Albright, L. M., Slatko, B. E. Denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. Curr ....
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Reimpressões e permissões
