Utarmning av specifika cellpopulationer med Komplettera Utarmning

Summary

För att effektivt studera funktionen av immunceller populationer deras rening krävs ofta. Komplettera utarmning är en snabb och billig teknik för isolering av immunceller populationer med hög renhet.

Abstract

Rening av immunceller populationer krävs ofta för att studera deras unika funktioner. I synnerhet molekylära metoder såsom realtids-PCR och microarray analys kräver isolering av cellpopulationer med hög renhet. Vanligen används rening strategier inkluderar fluorescerande aktiverad cell sortering (FACS), magnetisk pärla separering och komplettera utarmning. Av de tre strategier som erbjuder komplement utarmning fördelarna med att vara snabb, billig, skonsam mot cellerna och en hög cell avkastning. Komplementsystemet består av ett stort antal proteiner som när de aktiveras inleda en proteolytiska kaskad kulminerar i bildandet av ett membran-attack komplex som bildar en por på cellens yta resulterar i celldöd¹. Den klassiska vägen aktiveras av IgM och IgG-antikroppar och beskrevs först som en mekanism för att döda bakterier. Med genereringen av monoklonala antikroppar (mAb) kan komplettera kaskad användas till lyse någon cell befolkning i ett antigen-specifika sätt. Utarmning av celler som komplement kaskaden uppnås genom tillsats av antigen-specifika komplement fastställa antikroppar och kaninkomplement till startplatsen cellpopulation. Cellerna inkuberas i en timme vid 37 ° C och lyserade cellerna senare bort av två omgångar tvätt. MAb med hög verkningsgrad för komplementbindning bryter normalt 95-100% av de riktade cellpopulation. Beroende på rening strategi för den riktade cellpopulation, kan komplettera utarmning användas för cell rening eller för anrikning av cellpopulationer som sedan kan renas ytterligare genom ett senare metod.

Protocol

A. kaninkomplement Stock kaninkomplement ska tinas i rumstemperatur, och sedan alikvoteras till 0,5 och / eller 1 ml volymer och fryses vid -20-80 ° C för långtidsförvaring. Varje parti med komplement skall titreras för att bestämma optimal arbetsmiljö koncentration. Normalt är en utspädning på 1:10 till 1:20 optimal. Kaninkomplement inte alltid presterilized före försäljningen, beroende på den slutliga användningen av cellerna bör komplement filtreras steriliseras när alikvoteras och frysta eller före tillägg till cellerna. B. Antibody Urval Inte alla antikroppar är effektiva på att komplementaktivering därmed antikropparna först måste testas för aktivitet. Både mus och råtta mAb är effektiva på komplementaktivering. IgM-antikroppar är i allmänhet den mest effektiva för att användas som komplement-inducerad cellslys följt av IgG. IgG isotyper bäst för komplementaktivering varierar mellan olika arter. Varje antikropp bör titreras för optimal användning i en cell täthet av 10 7 celler / ml. C. Grundläggande Protokoll Justera start cellpopulation till 5 x 10 7 celler / ml i ett medium som innehåller värmeinaktiverad FCS. Den slutliga volymen av cellerna blir dubbelt start volym. Kom ihåg att spara några celler så att utarmning kan kvantifieras. Varje antikropp bör läggas till cellsuspensionen till den förutbestämda rätt koncentration eller utspädning. Blanda cellerna väl genom inversion. Beräkna mängden komplement behövs. Tina komplement lager i rumstemperatur. Om komplement är inte steril, sterilisera den med en låg proteinbindning sprutspetsen. Till sprutan, lägga till flera ml medium före tillägget av komplement och filtrera direkt i röret som innehåller celler och antikroppar. Justera den slutliga volymen i röret så att cellerna är på 1 x 10 7 celler / ml. Inkubera cellerna vid 37 ° C i en timme, blandning var 15 minut. Centrifugera cellerna och kassera supernatanten. Tvätta med medelhög två gånger. Cellfragment kommer att hålla till sidan av polystyren rör. Döda celler och smuts kan elimineras med hjälp av en cell sil eller genom densitetsgradient centrifugering. Kontrollera cellen renhet genom att jämföra cellpopulationen före och efter utarmning. Flödescytometri och immunhistokemi är två bra metoder för att bestämma cellens renhet. Representativa resultat När du använder en mAb som är mycket effektiv till att aktivera komplement cellbristen efter en runda är större då 95%. Detta visas i figur 1 där vi började med musen splenocytes som består av 32,2% celler αβ T som upptäckts av uttryck för TCRβ (eBioscience, San Diego, CA) med flödescytometri. Vi utarmat T-celler med hjälp av en mAb specifik för Thy1, ett protein som uttrycks av alla T-celler, men inte andra leukocyter. Antikroppen vi använde var Y-19 en råtta IgG2c 2. Efter det beskrivna förfarandet var TCRβ befolkningen minskat till 1,56%, en mer än 95% minskning. Figur 1. Utarmning av thy1 + var mjälten T-celler genom komplementaktivering. Totalt mus splenocytes erhålls genom homogenisering av mjälte och lys av RBC. Anti-thy1 och baby kaninkomplement vid i förväg bestämda koncentrationer lades till en enda cell suspension av splenocytes att den slutliga cellkoncentrationen var 1 x 10 7 celler / ml. Efter inkubation under 1 timme vid 37 ° C, var cellerna tvättas två gånger och utvärderas av trypan blå uteslutande av cellernas livskraft. Effektiviteten i utarmning bedömdes med flödescytometri jämföra andelen TCRβ + celler innan utarmning (till vänster) och efter utarmning (högra panelen). Den horisontella fältet indikerar positiv färgning och numret ovanför baren är den procent positiva.

Discussion

Rening av cellpopulationer är ett vanligt förfarande som krävs för att studera deras funktioner. Här beskriver vi en snabb och effektiv metod för brytande cellpopulationer med antigen-specifika antikroppar och komplement utarmning. Den utarmning av någon cell befolkningen kan uppnås om en komplement-aktivering antikropp är tillgänglig för en härstamning specifik markör. Här har vi visat på utarmning av T-celler med hjälp av en mAb specifik för Thy1, uttryckt ett protein genom att i princip alla T-celler. Vi utfiskade över 95% av αβ T-celler och resterande splenocytes ökade från 68% till 98%. Denna nivå av cell renhet liknar andra rening strategier inklusive FACS och magnetiska pärla separation. Komplettera utarmning är en snabb teknik som kan utföras i 1,5 timmar när den börjar cellpopulation erhålls. En annan fördel med komplement utarmning är att alla laboratorier kan utföra tekniken eftersom den inte kräver dyr utrustning och reagens. Det enda stora delar av utrustning som behövs är ett vattenbad och en centrifug. Kaninkomplement kan köpas från flera olika leverantörer till en rimlig kostnad (se tabell över reagenser) och många mAb kan köpas från ATTC och vuxit lokalt för att kontrollera kostnaderna. Däremot kräver FACS en flödescytometer med cellsortering kapacitet som kommer att kosta i sex siffror och dyra fluorescerande taggade MAB. Magnetisk pärla separation är prisvärda, men kräver inköp av en magnet och magnetiska kulor, vilket kan bli dyrt. Dessutom är vissa magnetiska sträng separation strategier kräver också köp av kolumnerna.

Den största stötestenen för användning av komplement till cellbristen är tillgången komplement aktivera mAb med erforderlig antigenspecificitet. Även mänskliga, mus och råtta-antikroppar alla har kapacitet att fixa ett komplement, en del isotyper är bättre än andra. Även IgM från alla tre arterna är mycket effektiv vid fastställande komplettera IgG isotyper variera. Således varje mAb måste först testas i en pilotstudie för att avgöra dess effektivitet. För antikroppar som inte är mycket effektiv, kan två omgångar av komplement utarmning utföras utan att påverka lönsamheten för de kvarvarande cellpopulationer. Som en kostnadsbesparing bör antikroppar titreras för optimal effektivitet. Dessutom behöver de använda antikropparna inte renas. Hybridomteknik supernatanterna och ascites vätska fungerar lika effektivt, vilket är särskilt bekvämt för IgM-antikroppar, som är svåra att rena. Precis som med antikroppar är det absolut nödvändigt att komplettera titreras i en pilotstudie. En för hög koncentration kommer att resultera i förlust av livskraft av icke-riktade cellpopulationer. Också viktigt är att inkubationstiden inte överstiger 60 minuter.

I våra protokoll samarbetar vi inkubera antikroppen och kompletterar varandra. Däremot kan cellerna märkas med antikroppar i 15-30 minuter och tvättas före tillsats av komplement. När du använder denna strategi, se till att utföra antikroppen inkubationer på is för att förhindra förlusten av cellen antigen på cellytan, vilket inträffar vid vissa proteiner med lapp och tak eller receptor internalisering. Även mycket effektiv, är den största nackdelen att komplettera utarmning jämfört med andra metoder att den inte kan användas för positiv selektion. Därför är det svårt att få subpopulationer av celler. Till exempel skulle det vara svårt att rena marginella celler zon B från celler follikulärt B, som bäst skulle ske genom FACS. I denna situation skulle kunna komplettera aktivering kunna användas för att tömma T-celler att minska antalet celler som sorteras. Denna strategi skulle minska den sortens tiden, vilket skulle spara pengar och skulle vara mindre hård mot cellerna.

Eftersom rening av specifika cellpopulationer är ett vanligt krav ett antal strategier har utvecklats. De främsta fördelarna med de kompletterar uttunningen strategin är dess överkomliga priser, teknisk enkelhet och spara tid.

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
3-4 week baby rabbit complement		Pel-Freez Biologicals	31061-3
Water bath		various	various	An incubator set at 37 °C can also be used.