Visualiseren Single moleculaire complexen In Vivo Geavanceerde fluorescentiemicroscopie
Summary
Hier laten we zien de protocollen voor het uitvoeren van single-molecule fluorescentie microscopie op levende bacteriële cellen in staat te stellen functionele moleculaire complexen worden opgespoord, gevolgd en gekwantificeerd.
Abstract
Volledig inzicht in de mechanismen van levende cellen kan alleen worden bereikt door het onderzoeken van de belangrijkste processen die uitlokken en gebeurtenissen direct op een cellulair niveau. Tot op heden is de schuifspanning complexiteit van biologische systemen heeft veroorzaakt precies single-molecule experimenten te ver veeleisend zijn, in plaats daarvan concentreren op studies van enkele systemen met behulp van relatief ruwe bulk ensemble-gemiddelde van metingen. Echter veel belangrijke processen zich voordoen in de levende cel op het niveau van slechts een of enkele moleculen; ensemble metingen over het algemeen het masker van de stochastische en heterogene karakter van deze gebeurtenissen. Hier, met behulp van geavanceerde optische microscopie en analytische beeldanalyse tools die we laten zien hoe eiwitten binnen een enkel levend bacteriële cel met een precisie van enkele moleculen en hoe we kunnen de dynamiek binnen de moleculaire complexen te observeren in het functioneren van biologische machines te controleren. De technieken zijn direct relevant zijn fysiologisch. Ze zijn minimaal-perturbatieve en niet-invasieve aan het biologische monster onder studie en zijn volledig afgestemd voor het onderzoek in levend materiaal, functies die niet direct beschikbaar zijn voor andere single-molecule benaderingen van biofysica. Daarnaast is de biologische monsters bestudeerde alle fluorescent-gelabelde eiwit te produceren op een niveau dat bijna identiek is aan de ongewijzigde celstammen ("genoom encoding"), in tegenstelling tot de meer gebruikelijke, maar minder ideale aanpak voor het genereren van aanzienlijk meer eiwitten dan zou van nature voorkomen ('plasmide expressie'). Dus de werkelijke biologische monsters die zullen worden onderzocht zijn aanzienlijk dichter bij de natuurlijke organismen, en dus de waarnemingen meer relevant zijn voor echte fysiologische processen.
Protocol
Discussion
Zorg moet worden genomen om geen "over shear" cel om naar te kijken aangebonden bacteriën, aangezien dit afbreuk doen aan de functionaliteit van de flagellaire motoren. Het is belangrijk om cellen die een keer te gebruiken voor veel langer dan een uur op de microscoop slide, omdat ze kunnen worden zuurstof uitgeput. Aanzienlijke optimalisatie kan nodig zijn om de beste imaging microscoop voorwaarden afgestemd op uw specifieke biologisch systeem in onderzoek. Het kan verstandig zijn om de beeldvorming met behu…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij erkennen het soort donaties van bacteriestammen uit de groepen van prof. dr. Judith Armitage (Universiteit van Oxford, Verenigd Koninkrijk) en prof. dr. Conrad Mullineaux (Queen Mary Universiteit van Londen, Verenigd Koninkrijk). IMD wordt gezamenlijk gefinancierd door de Afdeling Biochemie (Oxford University) en OCISB, AR wordt gefinancierd door een Engineering en Exacte Wetenschappen Research Council (EPSRC) DTC studententijd, ND wordt gefinancierd uit de biotechnologie en biologische wetenschappen Research Council (BBSRC); MCL is gefinancierd door een Royal Society Universiteit Research Fellowship.
Referências
- Leake, M. C., Chandler, J. H., Wadhams, G. H., Bai, F., Berry, R. M., Armitage, J. P. Stoichiometry and turnover in single, functioning membrane protein complexes. Nature. 443, 355-358 (2006).
- Leake, M. C., Greene, N. P., Godun, R. M., Granjon, T., Buchanan, G., Chen, S., Berry, R. M., Palmer, T., Berks, B. C. Variable stoichiometry of the TatA component of the twin-arginine protein transport system observed by in vivo single-molecule imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15376-15381 (2008).
- Leake, M. C., Wilson, D., Gautel, M., Simmons, R. M., M, R. The elasticity of single titin molecules using a two-bead optical tweezers assay. Biophys. J. 87, 1112-1135 (2004).
- Leake, M. C., Wilson, D., Bullard, B., Simmons, R. M. The elasticity of single kettin molecules using a two-bead laser-tweezers assay. FEBS Lett. , 535-555 (2003).
- Lenn, T., Leake, M. C., Mullineaux, C. W. In vivo clustering and dynamics of cytochrome bd complexes in the Escherichia coli plasma membrane. Mol. Microbiol. 70, 1397-1407 (2008).
- Lenn, T., Leake, M. C., Mullineaux, C. W. Are Escherichia coli OXPHOS complexes concentrated in specialised zones within the plasma membrane. Biochem. Soc. Trans. 36, 1032-1036 (2008).
- Lo, C. J., Leake, M. C., Pilizota, T., Berry, R. M. Single-cell measurements of Membrane Potential, Sodium-Motive Force and Flagellar Motor Speed in Escherichia coli. Biophys. 93, 294-302 (2007).
- Lo, C. J., Leake, M. C., Berry, R. M. Fluorescence measurement of intracellular sodium concentration in single Escherichia coli cells. Biophys. J. 90, 357-3565 (2006).
