Visualizar solo los complejos moleculares En Vivo Uso de microscopía de fluorescencia avanzada
Summary
Aquí nos demuestran los protocolos para la realización de una sola molécula de microscopía de fluorescencia en células vivas de las bacterias para permitir funcionales complejos moleculares para detectar, seguir y cuantificar.
Abstract
Una visión completa de los mecanismos de las células vivas sólo puede lograrse mediante la investigación de los procesos clave que provocan y dirigir los eventos a nivel celular. Hasta la fecha, la complejidad de corte de los sistemas biológicos ha provocado precisa una sola molécula de la experimentación a ser demasiado exigente, en lugar de centrarse en los estudios de sistemas de un solo uso a granel relativamente crudo media del conjunto de mediciones. Sin embargo, muchos procesos importantes ocurren en la célula viva en el ámbito de una o unas pocas moléculas, las mediciones del conjunto en general, la máscara de la naturaleza estocástica y heterogéneo de estos eventos. En este caso, mediante microscopía óptica avanzada y herramientas de análisis de análisis de imagen que se muestra cómo controlar las proteínas dentro de una sola célula viva bacteriana con una precisión de las moléculas individuales y cómo podemos observar la dinámica dentro de los complejos moleculares en el funcionamiento de máquinas biológicas. Las técnicas son directamente relevantes fisiológicamente. Son mínimamente perturbativa y no invasiva a la muestra biológica objeto de estudio y están totalmente adaptados para las investigaciones en la materia viva, las características no disponibles para los otros enfoques de una sola molécula de la biofísica. Además, las muestras biológicas estudiadas todos los productos de proteína fluorescente con etiquetas en niveles que son casi idénticas a las cepas de células no modificadas ("codificación genómica"), en comparación con el enfoque más común pero menos ideal para generar mucha más proteína que se producen de forma natural ('plásmido de expresión "). Por lo tanto, las muestras biológicas reales que serán investigados son significativamente más cerca de los organismos naturales, y por lo tanto, las observaciones más relevantes para los procesos fisiológicos reales.
Protocol
Discussion
Se debe tener cuidado de no "sobre corte" de células para observar las bacterias atados, ya que esto puede perjudicar la funcionalidad de los motores del flagelo. Es importante la utilización de las células durante mucho más tiempo de una hora una vez en el portaobjetos del microscopio, ya que puede convertirse en falta de oxígeno. Optimización considerable puede ser requerido para encontrar las mejores condiciones de microscopio de imagen atiende a su sistema biológico específico bajo investigación. …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Reconocemos los donativos en especie de las cepas bacterianas de los grupos de la Prof. Judith Armitage (Universidad de Oxford, Reino Unido) y el Prof. Conrad Mullineaux (Universidad Queen Mary de Londres, Reino Unido). IMD es financiado conjuntamente por el Departamento de Bioquímica (Universidad de Oxford) y OCISB; AR es financiado por una Ingeniería y Ciencias Físicas Research Council (EPSRC) becas para estudios de DTC, ND se financia con la Biotecnología y Ciencias Biológicas de Investigación (BBSRC), MCL es financiado por una beca Real Sociedad de Investigación de la Universidad.
Referências
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