Une évaluation quantitative du lipidome levure en utilisant la spectrométrie de masse électrospray ionisation

Summary

Nous décrivons une nouvelle méthode quantitative lipidomique pour identifier les espèces de lipides dans la levure à l'aide de nombreuses enquêtes-scan spectrométrie de masse electrospray ionisation (ESI / MS). Cette méthode dépasse actuellement les méthodes disponibles pour l'identification et la quantification des lipides dans la capacité à résoudre les diverses formes moléculaires de lipides, la sensibilité et la vitesse.

Abstract

Les lipides sont une des principales classes de biomolécules et de jouer des rôles importants dynamique de la membrane, le stockage de l'énergie, et la signalisation^1-4. La levure bourgeonnante<em> Saccharomyces cerevisiae</em>, Un eucaryote génétiquement et biochimiquement manipulable avec des unicellulaires génome annoté et lipidome très simple, est un précieux modèle pour étudier les fonctions biologiques des espèces lipidiques différents eucaryotes multicellulaires^2,3,5.<em> S. cerevisiae</em> A 10 principales classes de lipides avec des longueurs de chaîne principalement de 16 ou 18 atomes de carbone et zéro ou un degré d'insaturation^6,7. Les méthodes existantes pour l'identification et la quantification des lipides – comme la chromatographie liquide à haute performance, chromatographie sur couche mince, de microscopie par fluorescence et chromatographie en phase gazeuse suivie par MS – sont bien établis, mais ont une faible sensibilité, insuffisamment séparés diverses formes moléculaires de lipides, de lipides nécessitent dérivatisation avant à l'analyse, ou peut être beaucoup de temps. Nous présentons ici une description détaillée de notre approche expérimentale pour résoudre ces limitations inhérentes en utilisant l'enquête de balayage ESI / MS pour l'identification et la quantification de l'effectif total de lipides dans les cellules de levure. La méthode décrite ne nécessite pas de séparation chromatographique de mélanges de lipides complexes récupérés de cellules de levure, ce qui accélère considérablement le processus d'acquisition de données. Cette méthode permet l'identification et la quantification des lipides à des concentrations aussi faibles que g / ml et a été appliquée avec succès pour évaluer lipidomes des cellules de levure entier et leurs organites purifiés. L'extraction des lipides à partir des cellules de levure entière pour l'utilisation de cette méthode d'analyse des lipides prend deux à trois heures. Il ne faut que cinq à dix minutes à courir chaque échantillon de lipides extraits et séché sur un spectromètre de masse Q-TOF équipé d'une source de nano-électrospray.

Protocol

Matériel et méthodes Les souches de levures et de conditions de croissance La souche de type sauvage BY4742 (MATa his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) a été cultivé en milieu riche YEPD (extrait de levure 1%, 2% de peptone, glucose 2%). Les cellules ont été cultivées à 30 ° C avec rotation agitation à 200 rpm dans des erlenmeyers à un "flacon de volume / moyen volume" ratio de 5:1. Stockage des cellules de levure pour l'extraction des lipides Une …

Discussion

Cette méthode permet une évaluation quantitative rapide du lipidome levure à l'aide disponible, des matériaux peu coûteux. La méthode permet l'identification de la plupart des espèces de lipides dans les cellules de levure à l'exception de diacylglycérols, ergostérols et esters ergosteryl, bien que ces lipides peuvent être identifiés en remplaçant l'hydroxyde d'ammonium avec de l'hydroxyde de lithium. La méthode décrite permet l'identification et la quantification des lipides ?…