Transfection d'ADN des mammifères muscles squelettiques à l'aide In Vivo L'électroporation
Summary
Nous décrivons des procédures détaillées pour la transfection efficace de l'ADN plasmidique dans les fibres des muscles du pied des souris vivantes en utilisant l'électroporation et la visualisation ultérieure de l'expression des protéines en utilisant la microscopie à fluorescence.
Abstract
Un intérêt croissant pour la biologie cellulaire est d'exprimer des formes modifiées transgénique de protéines essentielles (par exemple les constructions fluorescence marqués et / ou de variants mutants) afin d'étudier leur distribution endogène et de la pertinence fonctionnelle. Une approche intéressante qui a été mis en œuvre pour atteindre cet objectif dans les cellules complètement différenciées est le<em> In vivo</emTransfection> de plasmides par diverses méthodes dans des tissus spécifiques tels que le foie<sup> 1</sup>, Le muscle squelettique<sup> 2,3</sup>, Et même le cerveau<sup> 4</sup>. Nous présentons ici une description détaillée des étapes qui doivent être suivies afin d'transfecter efficacement matériel génétique dans les fibres du<em> Court fléchisseur des orteils</em> (FDB) et<em> Interosseux</em> (OI) des muscles de souris adultes en utilisant une<em> In vivo</emApproche de l'électroporation>. Les paramètres expérimentaux ont été optimisés de manière à maximiser le nombre de fibres musculaires transfectées tout en minimisant les dommages tissulaires qui peuvent nuire à la qualité et la quantité des protéines exprimées dans les fibres individuelles. Nous avons vérifié que la mise en œuvre de la méthodologie décrite dans cet article les résultats d'un haut rendement de protéines solubles, soit EGFP et ECFP<sup> 3</sup>, La calpaïne, FKBP12, β2a-DHPR, etc; protéines structurales, c'est à dire minidystrophine et α-actinine et les protéines membranaires, soit α1s-DHPR, RyR1, cardiaques Na / Ca<sup> 2 +</sup> Échangeur, NaV1.4 canaux Na, SERCA1, etc, lorsqu'il est appliqué à FDB, IO et autres muscles de souris et de rats. L'expression efficace de certaines de ces protéines a été vérifiée avec biochimiques<sup> 3</sup> Et fonctionnelles des preuves<sup> 5</sup>. Cependant, de loin l'approche la plus commune de confirmation que nous utilisons sont la norme microscopie à fluorescence et la microscopie laser 2-photons balayage (TPLSM), qui permettent d'identifier non seulement l'expression d'ensemble, mais aussi la localisation intracellulaire détaillées, des constructions de protéines par fluorescence marqués. La méthode pourrait être également utilisé pour transfecter des plasmides codant pour l'expression des protéines de pertinence physiologique (comme ici), ou pour l'interférence ARN (siRNA) visant à supprimer l'expression des protéines normalement exprimés (non testé par nous encore). Il faut noter que la transfection de fibres musculaires FDB et IO est particulièrement pertinent pour l'enquête de la physiologie musculaire chez les mammifères car les fibres enzymatiquement dissocié de ces muscles sont actuellement l'un des modèles les plus appropriés pour étudier les mécanismes de base de couplage de l'excitabilité et excitation-contraction dans conditions pince de courant ou tension<sup> 2,6-8</sup>.
Protocol
Discussion
Nous décrivons ici les étapes détaillées qui doivent être suivies afin d'atteindre transfections efficace de plasmides ADN dans les fibres musculaires squelettiques par électroporation in vivo. Les principaux avantages de notre approche sont la simplicité de mise en œuvre et son caractère invasif minimal qui en résulte risque négligeable pour la santé des animaux. En réalité, les protocoles ci-dessus décrite électroporation n'entraînent pas beaucoup plus que les injections sous-cutanée…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr T. Otis, département de neurobiologie, UCLA, pour le partage de l'installation TPLSM avec nous, le Dr C. Fahlke, Institut de Physiologie, RWTH Aachen, en Allemagne, pour le don en nature du plasmide pEYFP-ClC1, et M. . R. Serrano pour le soutien technique. Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH / NIAMS subventions et AR047664 AR54816.
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