La transfección de ADN de músculos esqueléticos de mamíferos con En Vivo La electroporación
Summary
Se describen los procedimientos detallados para la transfección eficiente de ADN plásmido en las fibras de los músculos del pie de ratones vivos utilizando electroporación y la visualización posterior de la expresión de proteínas mediante microscopía de fluorescencia.
Abstract
Un creciente interés en la biología de las células es la de expresar las formas transgénicamente modificada de proteínas esenciales (por ejemplo, construye marcados con fluorescencia y / o variantes mutantes) con el fin de investigar su distribución endógena y la relevancia funcional. Un enfoque interesante que se ha implementado para cumplir con este objetivo en las células completamente diferenciadas es la<em> In vivo</em> Transfección de plásmidos por diversos métodos en tejidos específicos, tales como el hígado<sup> 1</sup>, El músculo esquelético<sup> 2,3</sup>, Y hasta el cerebro<sup> 4</sup>. Presentamos aquí una descripción detallada de los pasos que deben seguirse a fin de transfectar eficientemente material genético en las fibras de la<em> Flexor corto de los dedos</em> (FDB) y<em> Interóseo</em> (IO), los músculos de ratones adultos con un<em> In vivo</emEnfoque> electroporación. Los parámetros experimentales se han optimizado para maximizar el número de fibras musculares transfectadas y reducir al mínimo los daños al tejido que puede poner en peligro la calidad y cantidad de las proteínas expresadas en fibras individuales. Hemos comprobado que la aplicación de la metodología descrita en este artículo da lugar a un alto rendimiento de proteínas solubles, es decir, EGFP y ECFP<sup> 3</sup>, Calpaína, FKBP12, β2a-DHPR, etc, proteínas estructurales, es decir, minidistrofina y α-actinina, y proteínas de la membrana, es decir, α1s-DHPR, RyR1, cardiaca Na / Ca<sup> 2 +</sup> Intercambiador, NaV1.4 canal de Na, SERCA1, etc, cuando se aplica a la FDB, IO y otros músculos de los ratones y las ratas. La expresión eficaz de algunas de estas proteínas ha sido verificada con bioquímicos<sup> 3</sup> Y funcionales pruebas<sup> 5</sup>. Sin embargo, con mucho, el método de confirmación más comunes utilizados por nosotros son la microscopía fluorescente estándar y 2-fotón microscopía de escaneo láser (TPLSM), que permiten identificar no sólo la expresión global, sino también la localización intracelular detallada, de las construcciones de proteína marcado con fluorescencia. El método podría ser igualmente utilizado para transfectar plásmidos que codifican para la expresión de proteínas de relevancia fisiológica (como se muestra aquí), o de ARN de interferencia (siRNA) con el objetivo de suprimir la expresión de proteínas normalmente se expresa (no probado por nosotros con todo). Cabe señalar que la transfección de las fibras musculares y FDB IO es particularmente relevante para la investigación de la fisiología del músculo de mamíferos ya que las fibras disociadas enzimáticamente a partir de estos músculos son actualmente uno de los modelos más adecuados para investigar los mecanismos básicos de la excitabilidad y acoplamiento excitación-contracción en corriente o voltaje condiciones pinza<sup> 2,6-8</sup>.
Protocol
Discussion
Se describe aquí los pasos detallados que deben seguirse para alcanzar la transfección eficaz de los plásmidos de ADN en las fibras del músculo esquelético pt la electroporación in vivo. Las principales ventajas de nuestro enfoque es la simplicidad de implementación, y su mínima invasividad que se traduce en riesgo insignificante para la salud de los animales. En realidad, el anteriormente descrito protocolos de electroporación no implican mucho más que dos inyecciones subcutáneas por pie, s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Dr. T. Otis, del Departamento de Neurobiología de la UCLA, para compartir las instalaciones TPLSM con nosotros, el Dr. C. Fahlke, Instituto de Fisiología de la RWTH Aachen, Alemania, por la generosa donación del plásmido pEYFP-CLc1, y el Sr. . R. Serrano para soporte técnico. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del NIH / NIAMS AR047664 subvenciones y AR54816.
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