अलगाव और वयस्क मानव Endothelial कालोनी बनाने पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के बड़े पैमाने पर विस्तार
Summary
Endothelial कॉलोनी बनाने के पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं (ECFCs) संवहनी homeostasis और मरम्मत का अध्ययन करने के लिए एक आशाजनक उपकरण हैं.<sup1,2></sup> यह कागज एक उपन्यास जानवर सीरम heparinised जमा मानव प्लेटलेट (pHPL) lysate विरोधी गोजातीय प्रतिरक्षण के जोखिम ह्रासमान के साथ वयस्क मानव परिधीय रक्त से अलगाव और ECFC के विस्तार के लिए मुक्त विधि परिचय.
Abstract
इस कागज endothelial कॉलोनी बनाने heparinized से पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं (ECFCs) के लिए एक उपन्यास वसूली की रणनीति का परिचय है, लेकिन अन्यथा 12 दिनों का एक मतलब के भीतर वयस्क मानव परिधीय रक्त unmanipulated. बड़े पैमाने पर विस्तार के बाद> 1×10 8 ECFCs आगे के परीक्षण के लिए प्राप्त किया जा सकता है. Advantageously pHPL का उपयोग करके गोजातीय सीरम प्रतिजनों के साथ मानव कोशिकाओं के संपर्क को बाहर किया जा सकता है. प्रवाह cytometry और immunohistochemistry द्वारा अलग कक्षों ECFC और इन विट्रो कार्यक्षमता में उनकी संरचनाओं की तरह संवहनी फार्म एक matrigel परख में परीक्षण किया जा सकता है के रूप में लक्षण वर्णन किया जा सकता है. इसके अलावा इन कोशिकाओं subcutaneously एक माउस मॉडल में अंतःक्षिप्त किया जा सकता है vivo में कार्यात्मक, perfused वाहिकाओं के रूप में. लंबी अवधि के विस्तार और cryopreservation के प्रसार के बाद, समारोह और जीनोमिक स्थिरता के लिए संरक्षित किया जा दिखाई 3,4 .
यह पशु प्रोटीन मुक्त अलगाव और विस्तार विधि आसानी ECFCs की एक बड़ी मात्रा में उत्पन्न करने के लिए लागू होता है.
Protocol
Discussion
इस उपन्यास अलगाव और विस्तार विधि एक सरल और कुशल प्रक्रिया है कि और अधिक कुशल और कम समय खपत और किसी भी सेल जुदाई कोई घनत्व ढाल की जरूरत से बचने के द्वारा परम्परागत तकनीकों की तुलना में कम खर्चीला है. गोजा?…
Acknowledgements
लेखक pHPL और Margaretha Frühwirth और डेनिएला Thaler उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए प्रदान करने के लिए डॉ. Katharina Schallmoser धन्यवाद.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Endothelial basal Medium-2 |
Lonza | 500ml | ||
| EGM-2 SingleQuots | Lonza | EGF, hFGF-B, VEGF, IGF-1, Hydrocortisone, ascorbic acid | ||
| preservative-free Heparin |
Biochrom AG | 10U/ml per EGM-2 | ||
| L-Glutamine | Sigma | 2mM per EGM-2 | ||
| Penicillin and Streptomycin |
Sigma | 100U/mL Penicillin and 100μg/mL Streptomycin per EGM-2 |
||
| Trypsin/1mM EDTA | Gibco Cell Culture, Invitrogen |
7ml for T75 flask 70ml for CF-4 |
||
| PBS | ||||
| Four-layered cell factory (CF-4) |
Corning | |||
| Sterile Funnel | Corning | |||
| T75cm2 culture flask (with vented cap) | Corning | |||
| 6 mL vacutainer tubes (preservative-free sodium heparin) |
Becton Dickenson | preloaded with 108 IU/6ml of preservative-free sodium heparin |
||
| 50ml Falcon tubes | Falcon | |||
| 5ml Stripetts | Costar | |||
| 25ml Stripetts | Costar | |||
| Squeezer | Costar | |||
| 0,2 pore size sterile filter |
Millipore | 2x 500ml per EGM-2 |
Referências
- Solovey, A., Lin, Y., Browne, P., Choong, S., Wayner, E., Hebbel, R. P. Circulating activated endothelial cells in sickle cell anemia. N Engl J Med. 337, 1584-1590 (1997).
- Yoder, M. C., Mead, L. E., Prater, D. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109, 1801-1809 (2007).
- Schallmoser, K. Rapid large-scale expansion of functional mesenchymal stem cells from unmanipulated bone marrow without animal serum. Tissue Eng Part C Methods. 14, 185-196 (2008).
- Reinisch, A. Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo. Blood. , (2009).
- Ricardo, R., Phelan, K. Counting and Determining the Viability of Cultured Cells. J Vis Exp. , (2008).
