İzolasyon ve Büyük Ölçekli Genişleme Yetişkin İnsan Endotel Koloni Oluşturan Progenitör Hücreler
Summary
Endotel progenitör hücrelerin koloni oluşturan (ECFCs) vasküler homeostazı ve onarım çalışması için bir gelecek vaat eden bir araçtır.<sup> 1,2</sup> Bu kağıt, izolasyon ve anti-sığır aşılama riski azalan toplanmış insan trombosit lizatı (pHPL) heparinli yetişkin insan periferik kan ECFC genişlemesi için bir roman hayvan-serum ücretsiz bir yöntem.
Abstract
Bu kağıt heparinize gelen endotel progenitör hücrelerin koloni oluşturan (ECFCs) için yeni bir kurtarma stratejisi tanıttı ama aksi takdirde ortalama 12 gün içinde yetişkin insan periferik kan unmanipulated. > 1×10 8 ECFCs büyük ölçekli bir genişleme sonra, daha ileri testler için elde edilebilir. Avantajlı pHPL ile sığır serum antijenleri ile insan hücrelerinin kişi hariç tutulabilir. Akım sitometri ve immünohistokimyasal olarak izole hücreler ECFC ve in vitro işlevselliği gibi vasküler yapılar oluşturmak için bir matrigel tayininde test edilebilir olarak karakterize edilebilir . Ayrıca bu hücrelerin subkutan bir fare modelinde in vivo olarak fonksiyonel, perfüze damarları oluşturmak için enjekte edilebilir. Uzun vadeli büyüme ve kriyoprezervasyon çoğalması sonra, fonksiyon ve genomik istikrar korunmuş gibi görünüyor. 3,4
Bu hayvansal protein izolasyonu ve genişleme yöntemi ECFCs bir büyük miktarda üretmek için kolay uygulanabilir.
Protocol
Discussion
Bu roman izolasyon ve genişleme yöntemi, daha verimli ve daha az zaman alıcı ve herhangi bir hücre ayırma herhangi bir yoğunluk gradiyenti (gerekli) kaçınarak, geleneksel yöntemlere göre daha daha az pahalı bir basit ve verimli bir süreç. Büyükbaş antijen ve varsayılan sonraki xenoimmunization pHPL temas kullanarak dışındadır. Kültür dönemde küçük pıhtıları pHPL neden oluşturabilir. Tecrübelerimize dayanarak bu pıhtıları koloni oluşumu ve hücre çoğalması veya fonksiyon etkisi yok…
Acknowledgements
Yazarlar, mükemmel teknik destek için pHPL ve Margaretha Frühwirth ve Daniela Thaler sağlamak için Dr. Katharina Schallmoser teşekkür ederim.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Endothelial basal Medium-2 |
Lonza | 500ml | ||
| EGM-2 SingleQuots | Lonza | EGF, hFGF-B, VEGF, IGF-1, Hydrocortisone, ascorbic acid | ||
| preservative-free Heparin |
Biochrom AG | 10U/ml per EGM-2 | ||
| L-Glutamine | Sigma | 2mM per EGM-2 | ||
| Penicillin and Streptomycin |
Sigma | 100U/mL Penicillin and 100μg/mL Streptomycin per EGM-2 |
||
| Trypsin/1mM EDTA | Gibco Cell Culture, Invitrogen |
7ml for T75 flask 70ml for CF-4 |
||
| PBS | ||||
| Four-layered cell factory (CF-4) |
Corning | |||
| Sterile Funnel | Corning | |||
| T75cm2 culture flask (with vented cap) | Corning | |||
| 6 mL vacutainer tubes (preservative-free sodium heparin) |
Becton Dickenson | preloaded with 108 IU/6ml of preservative-free sodium heparin |
||
| 50ml Falcon tubes | Falcon | |||
| 5ml Stripetts | Costar | |||
| 25ml Stripetts | Costar | |||
| Squeezer | Costar | |||
| 0,2 pore size sterile filter |
Millipore | 2x 500ml per EGM-2 |
Referências
- Solovey, A., Lin, Y., Browne, P., Choong, S., Wayner, E., Hebbel, R. P. Circulating activated endothelial cells in sickle cell anemia. N Engl J Med. 337, 1584-1590 (1997).
- Yoder, M. C., Mead, L. E., Prater, D. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109, 1801-1809 (2007).
- Schallmoser, K. Rapid large-scale expansion of functional mesenchymal stem cells from unmanipulated bone marrow without animal serum. Tissue Eng Part C Methods. 14, 185-196 (2008).
- Reinisch, A. Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo. Blood. , (2009).
- Ricardo, R., Phelan, K. Counting and Determining the Viability of Cultured Cells. J Vis Exp. , (2008).
