Summary

वयस्क माउस से hippocampal दांतेदार गाइरस के विच्छेदन

Published: November 17, 2009
doi:

Summary

Stereomicroscope तहत वयस्क माउस से दांतेदार गाइरस को हटाने के लिए एक विच्छेदन तकनीक वीडियो दर्ज की इस प्रोटोकॉल में प्रदर्शन किया गया.

Abstract

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its remarkable neuronal cell plasticity, and its involvement in epilepsy, neurodegenerative diseases, and psychiatric disorders. The hippocampus is composed of distinct regions; the dentate gyrus, which comprises mainly granule neurons, and Ammon’s horn, which comprises mainly pyramidal neurons, and the two regions are connected by both anatomic and functional circuits. Many different mRNAs and proteins are selectively expressed in the dentate gyrus, and the dentate gyrus is a site of adult neurogenesis; that is, new neurons are continually generated in the adult dentate gyrus. To investigate mRNA and protein expression specific to the dentate gyrus, laser capture microdissection is often used. This method has some limitations, however, such as the need for special apparatuses and complicated handling procedures. In this video-recorded protocol, we demonstrate a dissection technique for removing the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope. Dentate gyrus samples prepared using this technique are suitable for any assay, including transcriptomic, proteomic, and cell biology analyses. We confirmed that the dissected tissue is dentate gyrus by conducting real-time PCR of dentate gyrus-specific genes, tryptophan 2,3-dioxygenase (TDO2) and desmoplakin (Dsp), and Ammon’s horn enriched genes, Meis-related gene 1b (Mrg1b) and TYRO3 protein tyrosine kinase 3 (Tyro3). The mRNA expressions of TDO2 and Dsp in the dentate gyrus samples were detected at obviously higher levels, whereas Mrg1b and Tyro3 were lower levels, than those in the Ammon’s horn samples. To demonstrate the advantage of this method, we performed DNA microarray analysis using samples of whole hippocampus and dentate gyrus. The mRNA expression of TDO2 and Dsp, which are expressed selectively in the dentate gyrus, in the whole hippocampus of alpha-CaMKII+/- mice, exhibited 0.037 and 0.10-fold changes compared to that of wild-type mice, respectively. In the isolated dentate gyrus, however, these expressions exhibited 0.011 and 0.021-fold changes compared to that of wild-type mice, demonstrating that gene expression changes in dentate gyrus can be detected with greater sensitivity. Taken together, this convenient and accurate dissection technique can be reliably used for studies focused on the dentate gyrus.

Protocol

Hippocampal दांतेदार गाइरस के विच्छेदन एक गहरी anesthetized माउस में, ध्यान से मस्तिष्क काटना खोपड़ी से बाहर है और यह बर्फ ठंड फॉस्फेट buffered खारा (पीबीएस) में जगह. बहुत ठंडा पीबीएस युक्त एक पेट्री डिश में, मस्तिष्क एक सर्जिकल चाकू का उपयोग कर के अनुदैर्ध्य विदर के साथ मस्तिष्क में कटौती, और बंद लैम्ब्डा के लिए पीछे क्षेत्रों (midbrain, hindbrain, और सेरिबैलम) में कटौती. मस्तिष्क गोलार्द्ध औसत दर्जे की ओर रखें और संदंश का उपयोग करने के लिए, ध्यान से एक विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे diencephalon (thalamus और hypothalamus) को हटा दें. इस हिप्पोकैम्पस के औसत दर्जे का पक्ष का पर्दाफाश, दांतेदार गाइरस के दृश्य के लिए अनुमति होगी. दांतेदार गाइरस अम्मोनियों सींग से उन दोनों के बीच अंतराल के द्वारा अलग पहचाना है. हिप्पोकैम्पस या आसपास के क्षेत्र के लिए चोट इसे और अधिक कठिन दांतेदार गाइरस को अलग करने के लिए कर देगा. दांतेदार गाइरस (दांतेदार गाइरस और अम्मोनियों के सींग की सीमाओं, चित्रा 1) के प्रत्येक पक्ष में एक तेज सुई की नोक (जैसे, 27 गेज सुई) डालें, और सुई अल्पज्ञता हिप्पोकैम्पस के अक्ष septo लौकिक के साथ अलग करने के लिए स्लाइड दांतेदार गाइरस. पृथक दांतेदार एक सुई या संदंश का उपयोग गाइरस उठाओ और यह एक नमूना ट्यूब में जगह है. इस प्रकार प्राप्त दांतेदार गाइरस ऊतक नमूना किसी भी परख के लिए तुरंत इस्तेमाल कर सकते हैं या बाद में उपयोग के लिए एक गहरे फ्रीजर में संग्रहीत. उसी पद्धति का उपयोग करके अन्य मस्तिष्क गोलार्द्ध से दांतेदार गाइरस पृथक. मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर दांतेदार गाइरस उपर्युक्त विधि और शेष हिप्पोकैम्पस अम्मोनियों जंगली प्रकार चूहों से सींग नमूना के रूप में dissected किया गया था का उपयोग कर पृथक किया गया. वास्तविक समय पीसीआर बीटा actin, TDO2, डीएसपी, Mrg1b और Tyro3 के दांतेदार गाइरस और अम्मोनियों के सींग के नमूने के रूप में एक पहले से वर्णित के साथ प्रदर्शन किया गया. 5'-CTGGCGAGATCACGATGACG प्राइमर्स और 5'-AAGCTACGCTGTTGTCTAACC Mrg1b, और GCCTCCAAATTGCCCGTCA और 5'-CCAGCACTGGTACATGAGATCA के लिए Tyro3 के लिए इस्तेमाल किया गया. माइक्रोएरे विश्लेषण (- चूहों अल्फा CaMKII + /) के रूप में एक पहले से वर्णित माइक्रोएरे प्रयोगों पुरुष जंगली प्रकार चूहों और कैल्शियम / calmodulin पर निर्भर प्रोटीन kinase द्वितीय के अल्फा isoform के लिए विषमयुग्मजी चूहों के साथ प्रदर्शन किया गया. संक्षेप में, पूरे या जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती चूहों के दांतेदार गाइरस हिप्पोकैम्पस से अलग शाही सेना एक माउस जीनोम 430 2.0 ऐरे (Affymetrix, सांता क्लारा, CA) के साथ संकरित किया गया था, और प्रत्येक GeneChip Affymetrix GeneChip 3000 स्कैनर (GCS3000) द्वारा स्कैन किया गया था . GeneChip विश्लेषण माइक्रोएरे विश्लेषण सूट संस्करण 5.0 के साथ प्रदर्शन किया था.

Discussion

दांतेदार गाइरस hippocampal 2,3 गठन की मात्रा का लगभग 25% से 30% रह रहे हैं. यह एक अद्वितीय सेल संरचना है और विभिन्न मस्तिष्क कार्यों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. इसलिए, तकनीक दांतेदार गाइरस अलग घटनाओं है कि इस क्षेत्र में विशेष रूप से पाए जाते हैं विश्लेषण करने के लिए उपयोगी होते हैं.

यहाँ, हम एक प्रक्रिया करने के लिए कुशलतापूर्वक वयस्क माउस हिप्पोकैम्पस से दांतेदार गाइरस काटना प्रदर्शन किया और तकनीक की शुद्धता की पुष्टि की. सबसे पहले, histologic अध्ययन से पता चला है कि दांतेदार गाइरस अन्य क्षेत्रों द्वारा संदूषण (चित्रा 1) के बिना अलग हो गया था, यह दर्शाता है कि एक शुद्ध दांतेदार गाइरस नमूना तैयार किया जा सकता है.

दूसरा, हम पुष्टि की है कि dissected ऊतक दांतेदार गाइरस विशिष्ट जीन, TDO2 और डीएसपी, और अम्मोनियों के सींग समृद्ध जीन, Mrg1b और Tyro3 4 (चित्रा 2) के वास्तविक समय पीसीआर द्वारा आयोजित दांतेदार गाइरस है. TDO2 के mRNA अभिव्यक्ति (= 0.०,००,०२३ पी, है n = 4 और 4, क्रमशः) और डीएसपी (= ०.००,००,०३० पी, है n = 4 और 4, क्रमशः) दांतेदार गाइरस नमूनों में स्पष्ट रूप से उच्च स्तर पर पाया गया है, जबकि Mrg1b (पी = 0.000080; है n = 4 और 4, क्रमशः) और Tyro3 (पी = ०.००,०१७; है n = 4 और 4, क्रमशः) अम्मोनियों के सींग के नमूनों में उन लोगों की तुलना में निचले स्तर पर थे. बीटा actin अभिव्यक्ति के स्तर को इन नमूनों में अलग नहीं किया था (= 0.11 पी; पता क्रमशः = 4 और 4). इस प्रकार, हम जाँच कर सकता है चाहे या नहीं दांतेदार गाइरस सही में सरल वास्तविक समय पीसीआर प्रयोगों द्वारा आयोजित बाहर dissected था.

तीसरा, इस विच्छेदन पद्धति की उपयोगिता का आकलन करने के लिए, हम दांतेदार गाइरस के साथ कि पूरे हिप्पोकैम्पस के mRNA अभिव्यक्ति के स्तर की तुलना में. पूरे हिप्पोकैम्पस और दांतेदार गाइरस है पता क्रमशः 9 = और 4, जंगली – प्रकार और अल्फा – CaMKII + / से प्राप्त – चूहों (है पता 18 = और 4, क्रमशः) माइक्रोएरे विश्लेषण के लिए संसाधित थे, और के लिए सभी जीनों रन बनाए, गुना – परिवर्तन जंगली प्रकार मूल्य द्वारा उत्परिवर्ती मूल्य विभाजित करके गणना की थी. परिणाम संकेत दिया कि mRNA अभिव्यक्ति में परिवर्तन, डीएसपी और TDO2 जैसे दांतेदार विशिष्ट – गाइरस अणुओं की विशेष रूप से, के साथ पाया गया दांतेदार गाइरस नमूनों में संवेदनशीलता में एक 5 गुना पूरे hippocampal नमूने (1 टेबल) की तुलना में वृद्धि हुई है. हम पहले दिखा दिया कि अल्फा CaMKII + / – चूहों एक्ज़िबिट व्यवहार काम स्मृति घाटे और एक अतिरंजित infradian 1,5 ताल के रूप में मानव मानसिक विकारों से संबंधित है. इसके अलावा, उत्परिवर्ती चूहों में दांतेदार गाइरस न्यूरॉन्स के शब्द के भागों और electrophysiologic सुविधाओं strikingly अपरिपक्व सामान्य कृन्तकों में दांतेदार गाइरस न्यूरॉन्स के उन लोगों के लिए समान हैं, यह दर्शाता है कि इन उत्परिवर्ती चूहों में न्यूरॉन्स 1 परिपक्वता को विकसित करने में विफल. अपरिपक्व डीएसपी के दांतेदार गाइरस और नीचे विनियमित अभिव्यक्ति और अल्फा CaMKII TDO2 mRNA + / – चूहों लग रहा है कि डीएसपी और TDO2 दांतेदार गाइरस (Ohira एट अल में परिपक्व ग्रेन्युल कोशिकाओं के मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है के साथ संगत कर रहे हैं, अप्रकाशित. डेटा).

साथ में ले ली, इस सुविधाजनक और सटीक विच्छेदन तकनीक मज़बूती दांतेदार गाइरस पर ध्यान केंद्रित अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. दांतेदार गाइरस इस पद्धति का उपयोग करने के लिए प्राप्त ऊतक विश्लेषण के प्रोटिओमिक और कोशिका जीव विज्ञान के विश्लेषण सहित अन्य प्रकार के रूप में अच्छी तरह से, के लिए लागू है.

1 आंकड़ा
चित्रा 1 histologic अध्ययन द्वारा पृथक दांतेदार गाइरस का सत्यापन. दांतेदार गाइरस अलग करने के बाद मस्तिष्क का राज्याभिषेक अनुभाग Nissl धुंधला (बाएं पैनल) के लिए संसाधित किया गया था, और एक योजनाबद्ध माउस मस्तिष्क atlas6 से अनुकूलित आरेख बाईं पैनल (सही पैनल) में दिखाया गया है अनुभाग के लगभग एक ही स्तर का प्रतिनिधित्व करता है. तीर सम्मिलन सुई की नोक के निर्देशों से संकेत मिलता है. स्केल बार, 1 मिमी.

चित्रा 2
चित्रा 2 वास्तविक समय पीसीआर द्वारा पृथक दांतेदार गाइरस का सत्यापन. दांतेदार गाइरस और अम्मोनियों सींग की चार जंगली प्रकार चूहों से प्राप्त बीटा actin के वास्तविक समय पीसीआर, TDO2, डीएसपी, Mrg1b और Tyro3 के लिए प्रोसेस किया गया. परिणाम प्रस्तुत कर रहे हैं के रूप में ± SEM मतलब है. सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए, छात्र टी परीक्षण नियोजित किया गया था और पी मूल्यों का पालन कर रहे हैं: बीटा actin, पी = 0.11; TDO2, पी .०,००,०२३ = (1 **); डीएसपी, (2 ** .००,००,०३० = पी) , Mrg1b, पी = 0.000080 (** 3), और Tyro3, ​​पी = (4 ** ०.०००१७).

तालिका 1. पूरे हिप्पोकैम्पस और दांतेदार गाइरस के माइक्रोएरे विश्लेषण जीन विभिन्न दांतेदार गाइरस और अल्फा CaMKII के पूरे हिप्पोकैम्पस में व्यक्त + / – चूहों जंगली प्रकार चूहों में पता चला है कि से गुना परिवर्तन की गणना के द्वारा निर्धारित किया गया है. चूहों – डेटा सांख्यिकीय जंगली प्रकार और अल्फा CaMKII + / के बीच छात्र टी परीक्षण का उपयोग कर के महत्व के लिए विश्लेषण किया गया. जीन के अलावा जिनकी अभिव्यक्ति <0.05 पी में प्रदर्शितअल्फा CaMKII + / दांतेदार गाइरस – कि जंगली प्रकार चूहों की तुलना में चूहों, शीर्ष 50 जीनों सूचीबद्ध हैं. ध्यान दें कि दांतेदार गाइरस के लिए नमूनों की संख्या पूरे हिप्पोकैम्पस के लिए उन लोगों की तुलना में बहुत कम हैं. AffyID, Affymetrix जांच पहचानकर्ता, CKII, अल्फा CaMKII + / – चूहों, WT, जंगली प्रकार चूहों.

<td> Neuronal / / 2 pentraxin / काल्पनिक प्रोटीन LOC100044234
दांतेदार गाइरस (पी <0.05)
WT: n = 4, CKII + / -: n = 4
पूरे हिप्पोकैम्पस
WT: n = 9, CKII + / -: n = 18
जीन शीर्षक Genebank AffyID मोड़ो परिवर्तन पी मूल्य मोड़ो परिवर्तन पी मूल्य
desmoplakin AV297961 1435494_s_at ०.०१,१०,१८,९१३ 7.02694E – 06 ०.०३७०२१००३ 1.86126E – 13
desmoplakin AV297961 1435493_at 0.०१,४३,६९,७३४ 7.86747E – 06 0.04232106 1.00579E – 12
2,3-dioxygenase tryptophan AI098840 1419093_at .०२०९८६४८४ 5.23546E – 09 0.१०१०३७७७६ 4.14823E – 13
nephronectin AA223007 1452106_at ०.०७,५४,७९,९०१ 1.05191E – 08 0.२३४००११५४ 1.66301E – 15
nephronectin AA223007 1452107_s_at 0.०७९४५७७६७ 1.40433E-07 ०.१७,७९,७४,७१५ 3.9758E-12
thyrotropin हार्मोन रिसेप्टर रिहा M59811 1449571_at 0.१०३१०५८१५ .००३०९३७९६ ०.८०,१४,१२,७३२ .२८,३९,९४,३६१
ryanodine 1 रिसेप्टर, कंकाल की मांसपेशी X83932 1427306_at .१०४८२५५१७ 3.38513E-07 0.६५०६८५०१७ 0.०००३०८४६२
अनभिज्ञा हेलिक्स पाश एक हेलिक्स NM_010916 1419533_at 9.431896 6.7979E-06 4.078815314 5.27E-11
copine परिवार के सदस्य ग्यारहवीं BB274531 1454653_at 9.159157 7.99492E – 06 1.797304153 0.००,०२,९६,३७५
doublecortin तरह तीन kinase BB326709 1436532_at ०.१०,९३,३६,६६२ 1.95278E-07 0.56697229 2.62633E – 08
3 calpain AF127766 1426043_a_at 0.१११२६९७६९ 8.07053E – 06 .३७,०९,५६,६०८ 2.04421E – 14
वयस्क पुरुष कोष striatum सीडीएनए, पूर्ण लंबाई आरआईकेईएन समृद्ध पुस्तकालय, क्लोन: C030023B07 उत्पाद: unclassifiable, पूर्ण डालने अनुक्रम BB357628 1460043_at ०.११,८७,१२,३४१ 6.16926E-07 ०.६८,२३,३९,२०४ 2.33001E – 06
कोलेजन और कैल्शियम बाध्यकारी EGF एक डोमेन AV264768 1437385_at 0.१२४०४३९७८ 3.65669E-05 0.४८८३९४११२ 4.05538E – 06
(A4) amyloid प्रोटीन अग्रदूत बाध्यकारी, परिवार के एक सदस्य 2 बंधनकारी प्रोटीन बीटा AK013520 1431946_a_at 7.7986307 1.2098E-06 2.099164713 1.67047E – 06
calbindin-28K BB177770 1456934_at .१३,०२,५५,४४४ 3.32186E – 06 .५७२६०५७५१ 1.99157E – 10
लिखित ठिकाना AV328597 1443322_at ०.१३,३२,९०,८३५ 5.43583E – 06 ०.५६२७६७१६४ 7.56544E – 06
neuropeptide वाई रिसेप्टर Y2 NM_008731 1417489_at .१३५३१९६०९ ०.०००११३४०७ .७८,१४,९८,४७४ 0.00394504
रास उत्तरदायी तत्व बंधनकारी प्रोटीन 1 BE197381 1428657_at 0.१३,८२,३५,११४ 7.93691E-07 ०.६५१२२०७०५ 2.94209E-05
glial सेल लाइन neurotrophic कारक परिवार रिसेप्टर व्युत्पन्न अल्फा 2 BB284482 1433716_x_at ०.१३९०६२५६३ 2.35371E – 06 .६६९५४४७०९ ०.०००२१४१४६
1 preproenkephalin M13227 1427038_at 6.9850435 2.39074E – 08 1.766018828 .००,०२,५०,५०१
आरआईकेईएन सीडीएनए 1810010H24 जीन BI729991 1428809_at 6.8658915 1.88516E-05 2.77573142 6.81865E – 09
ryanodine 1 रिसेप्टर, कंकाल की मांसपेशी BG793713 1457347_at .१५,१३,६४,२९२ 3.35612E-05 ०.५०,३१,४४,६१७ 4.32907E-05
21 protocadherin NM_130878 1418304_at .१५,२६,७१,८४९ 8.57783E – 06 0.६७०७१४७२६ 1.56309E-05
cornichon 3 homolog (ड्रोसोफिला) NM_028408 1419517_at .१५३७२४१४४ 8.90755E – 06 0.95780695 0.६६१०५५६०८
harakiri, BCL2 बातचीत प्रोटीन (केवल BH3 डोमेन शामिल हैं) BQ175572 1439854_at ०.१५,४२,८४,४०७ 2.0118E-05 0.56516812 4.86925E – 09
कार्बोहाइड्रेट (एन acetylgalactosamine 4-0) sulfotransferase 9 AK017407 1431897_at ०.१५,५२,३८,९५१ 5.37423E – 06 1.14910007 .२१,५६,३७,७३३
3 calpain AI323605 1433681_x_at 0.१६,०८,७१,९८८ 1.07655E-05 0.४७७१६४७५७ 1.33753E – 11
जस्ता उंगली, CCHC 5 युक्त डोमेन BQ126004 1437355_at .१६१८१२०७८ 3.08262E – 06 0.४२,१२,५२,६३२ 0.01152969
loricrin NM_008508 1448745_s_at .१६५१२९९६७ 1.86362E-05 0.६३,९७,३३,४०९ 0.०००७२९७७२
1 spondin, (च spondin) बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन BC020531 1451342_at 0.१६८०३५८७९ 6.67867E-07 ०.८२१०४२४१२ 0.०२३६५०७६५
आरआईकेईएन सीडीएनए जीन A930035E12 AV348640 1429906_at 5.9086795 1.747E-07 1.470383201 ०.१०,४०,८५,४५४
BB247294 आरआईकेईएन पूर्ण लंबाई समृद्ध, 7 दिनों नवजात शिशु सेरिबैलम मुसलमानों मस्कुलस सीडीएनए क्लोन A730018G18 3 ', mRNA अनुक्रम. BB247294 1447907_x_at 5.9047494 1.04931E-05 1.968147585 0.00010636
FERM डोमेन 3 युक्त BB099015 1437075_at 5.860216 ०.००,०३,४५,५८१ 2.780297178 1.83072E – 06
NM_016789 1420720_at 5.7568517 1.34227E – 06 2.652516957 ०.००,०२,०६,२७९
लिखित दृश्यों BG076361 1460101_at 5.657735 2.5015E-06 1.296248831 0.22870031
1 spondin, (च spondin) बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन BC020531 1424415_s_at 0.17783576 1.01658E – 06 .८३,६१,८१,२४८ 0.००,१३,८०,१४१
calbindin-28K BB246032 1448738_at .१८०३१७९०४ 1.35961E-05 0.६४,७३,३४,०५२ 4.12268E – 09
1 MARCKS की तरह AV110584 1437226_x_at ०.१८६२३५९३५ 1.47067E – 06 0.४९,९२,९१,३८७ 2.34984E – 08
2 matrilin BB338441 1455978_a_at .१८७७८३५२८ 6.19122E-05 0.8967688 0.२८२३३७८५३
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1 spondin, (च spondin) बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन BQ175871 1442613_at ०.१८९९५६५६३ 9.41195E – 06 .८६१०३३२२२ 0.1394266
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आरआईकेईएन सीडीएनए जीन A330050F15 AV325555 1457558_at 0.19186781 0.००,०१,१९,३४२ 0.६६०२८२०३५ 2.47342E-05
3 contactin BB559510 1438628_x_at .१९४४०४६०८ 4.08641E-07 0.९१,८७,४२,५९१ 0.०२,२५,४५,२९७
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proprotein convertase / subtilisin Kexin 5 प्रकार BB241731 1437339_s_at 0.२१,०५,२८,०२७ 7.83039E-05 ०.५७,४१,२६,०७८ 9.15496E-05
इंटरल्यूकिन 1 रिसेप्टर, मैं लिखें NM_008362 1448950_at .२१,०५,७२,२४३ 9.64524E – 06 .२४११३५३५२ 2.79816E – 08

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

हम क्योटो विश्वविद्यालय में विच्छेदन और उसे फिल्म के लिए समर्थन के लिए तकनीक Fujita स्वास्थ्य विश्वविद्यालय में सुश्री अकी Miyakawa पर उसके अनुदेश के लिए डॉ. योको Nabeshima धन्यवाद. जापान में MEXT से दर – इस काम बायोमेडिकल अभिनव क्षेत्रों एकीकृत ब्रेन रिसर्च (Shien) की प्राथमिकता पर वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए अनुदान सहायता के राष्ट्रीय संस्थान स्वास्थ्य विज्ञान में मौलिक अध्ययन के संवर्धन के लिए प्रोग्राम के द्वारा समर्थित किया गया एक अनुदान सहायता में जापान विज्ञान और प्रौद्योगिकी एजेंसी के शिखा से.

Referências

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Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse. J. Vis. Exp. (33), e1543, doi:10.3791/1543 (2009).

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