कई वैज्ञानिक अध्ययन के लिए सेल आबादी का एक जैविक और रासायनिक विश्लेषण की आवश्यकता कोशिकाओं शुद्धता की एक उच्च राज्य में होना चाहिए. प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) जिसमें शुद्ध सेल आबादियों को प्राप्त करने के लिए एक बेहतर तरीका है.
प्रायोगिक और नैदानिक अध्ययन अक्सर अत्यधिक सेल आबादी शुद्ध की आवश्यकता होती है. FACS पसंद की एक तकनीक के लिए जाना जाता phenotype के सेल आबादी को शुद्ध है. शुद्धि के अन्य थोक तरीकों panning, पूरक रिक्तीकरण और चुंबकीय मनका जुदाई शामिल हैं. हालांकि, FACS अन्य उपलब्ध तरीकों पर कई फायदे हैं. FACS पसंदीदा तरीका है जब वांछित जनसंख्या का बहुत ही उच्च शुद्धता की आवश्यकता होती है, जब लक्ष्य सेल की आबादी पहचान मार्कर के एक बहुत कम स्तर व्यक्त या जब सेल आबादी जुदाई अंतर मार्कर के घनत्व के आधार पर की आवश्यकता होती है. इसके अलावा, FACS ही उपलब्ध शुद्धि आंतरिक धुंधला हो जाना या intracellular प्रोटीन अभिव्यक्ति पर आधारित एक आनुवंशिक रूप से संशोधित फ्लोरोसेंट प्रोटीन मार्कर के रूप में ऐसी कोशिकाओं को अलग तकनीक है. FACS की अनुमति देता है अलग – अलग आकार granularity, और प्रतिदीप्ति के आधार पर कोशिकाओं की शुद्धि. आदेश में ब्याज की कोशिकाओं को शुद्ध करने के लिए, वे पहले fluorescently टैग मोनोक्लोनल (एमएबी) एंटीबॉडी, जो वांछित सेल की आबादी (1) पर विशिष्ट सतह मार्करों की पहचान के साथ दाग रहे हैं. बेदाग कोशिकाओं के नकारात्मक चयन भी संभव है. FACS शुद्धि छँटाई क्षमता और उचित सॉफ्टवेयर के साथ एक प्रवाह cytometer की आवश्यकता है. FACS के लिए, निलंबन में कोशिकाओं प्रत्येक के साथ एक लेज़र के सामने में एक एकल कोशिका युक्त बूंदों में एक धारा के रूप में पारित कर रहे हैं. प्रतिदीप्ति पहचान प्रणाली कक्षों की पूर्व निर्धारित फ्लोरोसेंट मापदंडों के आधार पर ब्याज की कोशिकाओं का पता लगाता है. साधन ब्याज की एक सेल और एक electrostatic विक्षेपन प्रणाली उपयुक्त संग्रह ट्यूब (2) में चार्ज बूंदों के संग्रह की सुविधा युक्त छोटी बूंद के लिए एक प्रभारी लागू होता है. धुंधला की सफलता और जिससे छँटाई पहचान मार्करों और MAB की पसंद के चयन पर काफी हद तक निर्भर करता है. छंटनी मापदंडों पवित्रता और उपज की आवश्यकता के आधार पर समायोजित किया जा सकता है है. हालांकि FACS विशेष उपकरण और कर्मियों को प्रशिक्षण की आवश्यकता है, यह अत्यधिक सेल आबादी को शुद्ध करने के अलगाव के लिए पसंद की विधि है.
FACS ब्याज की सेल आबादी, जो में सॉर्ट किया गया आबादी का एक बहुत उच्च शुद्धता (95-100%) प्राप्त किया जा सकता है सफ़ाई के लिए एक अत्यधिक परिष्कृत तकनीक है. इसलिए, इस तकनीक का प्रयोग, जहां उच्च शुद्धता एक अनिवार्य आवश्यकता है (जैसे माइक्रोएरे विश्लेषण) के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है. FACS शुद्धि के अन्य तरीकों पर उपलब्ध विशेष रूप से लाभप्रद है जब एक सेल की आबादी एक साप्ताहिक व्यक्त की सतह मार्कर के आधार पर शुद्ध जरूरत है या जब दो या दो से अधिक आबादी है जो एक ही सतह मार्कर की अभिव्यक्ति के विभिन्न स्तरों है शुद्ध करने की आवश्यकता है. उदाहरण के लिए, सीमांत क्षेत्र की शुद्धि बी कोशिकाओं (B220 + CD21 हाय CD23 int / कम) और कूपिक बी कोशिकाओं (B220 + CD21 int / कम हाय CD23) CD21 और CD23 की अभिव्यक्ति के स्तर पर आधारित है . FACS के एक और बढ़ती आवेदन एकल कक्ष छँटाई व्यक्ति की कोशिकाओं के विश्लेषण (3, 4) की अनुमति है. FACS भी सामान्यतः तरह फ्लोरोसेंट प्रोटीन जैसे हरे रंग का फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग प्रोटीन (5) है कि आनुवंशिक रूप से व्यक्त कर रहे हैं व्यक्त की कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया. यदि एक बाँझ सॉर्ट किया जाता है कोशिकाओं सुसंस्कृत हो सकते हैं. हालांकि, सेल व्यवहार्यता और उपज छँटाई के दौरान समझौता किया जा सकता है. व्यवहार्यता सॉर्टिंग के लिए एक सेल निर्भर अधिकतम तापमान का उपयोग करके और संग्रह ट्यूबों तुरंत प्रसंस्करण के बाद वे क्षमता तक पहुँचने के द्वारा सुधार किया जा सकता है. रिकवरी polypropylene संग्रह ट्यूबों का उपयोग कर, सीरम अमीर मीडिया और inverting संग्रह ट्यूबों रहकर में सॉर्ट कोशिकाओं को इकट्ठा, एक इष्टतम तापमान पर संग्रह ट्यूबों को बनाए रखने और ~ 10 मिनट (http://cyto.mednet.ucla.edu के लिए हल कोशिकाओं centrifuging की वृद्धि हुई किया जा सकता है है / Protocol.htm).
अल्ट्रा उच्च गति sorters के विकास के नैदानिक सेटिंग में छँटाई प्रवाह के आवेदन की संभावना बढ़ा दिया गया है. FACS के संभावित नैदानिक अनुप्रयोगों के उपचारात्मक उद्देश्यों के कैंसर के उपचार में आवेदन, amniocentesis प्रतिस्थापन, मानव शुक्राणु और जल्दी रोग detections (6, 7) छँटाई के लिए मानव रक्त से रक्त स्टेम कोशिकाओं की शुद्धि शामिल हैं.
बहुरंगा धुंधला के लिए, एंटीबॉडी चयन एक महत्वपूर्ण कदम है और fluorochromes प्रत्येक विशेष उपकरण के लिए पहचान प्रणाली के आधार पर चुना जाता है. वहाँ कंपनियों है कि उपयोगकर्ता की जरूरत के अनुसार सेल sorters और लेजर विन्यास बदलता बेचते के एक नंबर रहे हैं. इस प्रकार एक बस सटीक एक ही संगतता की पुष्टि के बिना प्रकाशित अध्ययन में इस्तेमाल किया एंटीबॉडी का उपयोग नहीं कर सकते हैं. इष्टतम एंटीबॉडी के चयन के लिए, एक जांच की जा रही प्रोटीन की अभिव्यक्ति के स्तर पर विचार करना चाहिए. सामान्य में, प्रतिभाशाली उपलब्ध fluorochrome टैग एंटीबॉडी dimly सतह मार्करों व्यक्त दाग होना चाहिए, जबकि मंद fluorochromes अत्यधिक व्यक्त की सतह मार्करों (8) के धुंधला के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, एंटीबॉडी इस तरह से है कि उनके उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के बीच ओवरलैप में चयनित किया जाना चाहिए कम से कम है. बहुरंगा धुंधला के लिए, यह बहुत मुश्किल है fluorochrome चुन है कि कोई वर्णक्रमीय ओवरलैप. इस स्थिति में, मुआवजा किया जाता है.
मुआवजा आवश्यक है गणितीय विभिन्न fluorochromes कि डिटेक्टरों (8-10) द्वारा measureable है के उत्सर्जन स्पेक्ट्रम के बीच प्रतिदीप्ति ओवरलैप को खत्म करने. दूसरे शब्दों में, एक fluorochrome से प्रतिदीप्ति ओवरलैप दूसरे fluorochrome के उत्सर्जन स्पेक्ट्रम से subtracted है. मुआवजे की गणना एक अस्थिर नियंत्रण और प्रत्येक fluorochrome के लिए एक सकारात्मक एक बहुरंगा धुंधला (9, 10) के लिए इस्तेमाल किया नियंत्रण की आवश्यकता है. मुआवजा कक्षों या मोतियों का उपयोग किया जा सकता है. मोती आसान दाग, एक मजबूत संकेत है और एकल दाग नियंत्रण है कि प्रयोगात्मक नमूने के रूप में एक ही fluorophores की तैयारी का एक आसान तरीका प्रदान करते हैं. मुआवजा मोतियों विशेष रूप से लाभप्रद है जब ब्याज की कोशिका की सतह प्रोटीन एक कम स्तर पर व्यक्त की है और जब ब्याज की सेल की आबादी प्रारंभिक शुरू सेल आबादी में सीमित है.
एक बार एंटीबॉडी चुना गया है, उनकी गतिविधि एक टाइट्रेट करना विश्लेषण प्रदर्शन द्वारा अनुकूलित किया जाना चाहिए. यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है अगर FACS अत्यधिक शक्तिशाली लेजर मशीन है. धुंधला एंटीबॉडी के suboptimal सांद्रता का उपयोग वांछित सेल की आबादी का कुल सेल की आबादी से गरीब जुदाई में परिणाम कर सकते हैं. उच्च प्रतिरक्षी सांद्रता का उपयोग गैर विशिष्ट प्रतिजन धुंधला के लिए मौका बढ़ जाती है. इसलिए एंटीबॉडी अनुमापन एंटीबॉडी एकाग्रता का चयन है कि सकारात्मक जनसंख्या और कम से कम पृष्ठभूमि धुंधला (8) की अधिकतम चमक देता है की अनुमति देगा.
FACS अब कक्षों की subpopulations की शुद्धि के लिए एक मानक तकनीक है. यह जिसमें एक एकल कक्ष निलंबन और उत्पन्न किया जा सकता है एंटीबॉडी वांछित सेल की आबादी की पहचान के लिए उपलब्ध हैं किसी भी कोशिका प्रकार अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. FACS पसंद की विधि है घंटे जबighly शुद्ध सेल आबादी के लिए आवश्यक हैं.
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