Rening av specifik cell Befolkningen efter Fluorescens Aktivt cellsortering (FACS)

Summary

För många vetenskapliga studier som kräver en biologisk och kemisk analys av cellpopulationer cellerna måste vara i en hög tillstånd av renhet. Fluorescens aktiverad cell sortering (FACS) är en överlägsen metod där för att få rena cellpopulationer.

Abstract

Experimentella och kliniska studier kräver ofta mycket rent cellpopulationer. FACS är en teknik val för att rena cellpopulationer av kända fenotyp. Andra delen metoder för rening inkluderar panorering, kompletterar utarmning och magnetiska pärla separation. Dock har FACS flera fördelar jämfört med andra tillgängliga metoder. FACS är den bästa metoden när mycket hög renhet av önskad befolkningen krävs, när målcellpopulationen uttrycker en mycket låg nivå identifiera markör eller när cellpopulationer kräver separation baserad på differentiell markör densitet. Dessutom är FACS den enda tillgängliga reningsteknik att isolera celler baserat på interna färgning eller intracellulärt protein uttryck, såsom en genetiskt modifierad fluorescerande protein markör. FACS medger rening av enskilda celler baserat på storlek, granularitet och fluorescens. För att rena celler av intresse, är de först färgats med fluorescerande-märkta monoklonala antikroppar (mAb), som erkänner specifik yta markörer på önskad cellpopulation (1). Negativt urval av ofärgade celler är också möjligt. FACS rening kräver en flödescytometer med sortering kapacitet och lämplig mjukvara. För FACS, celler i suspension skickas som en ström i små droppar med var och en innehåller en enda cell framför en laser. Fluorescensen upptäckt systemet upptäcker celler av intresse grundar sig på förutbestämda fluorescerande parametrar av cellerna. Instrumentet tillämpar en avgift för att droppen som innehåller en cell av intresse och en elektrostatisk nedböjning Systemet underlättar insamling av laddade droppar in lämpliga insamlingssystem rör (2). Framgången för färgning och därmed sortering stor del beror på valet av att identifiera markörer och valet av MAB. Sortering parametrar kan justeras beroende på kravet på renhet och avkastning. Även FACS kräver specialiserad utrustning och utbildning av personal, är det viktigaste metoden för isolering av renade cellpopulationer.

Protocol

Innan processen startar, följande punkter måste vara att samlas in och bearbetade: Ice 15 ml koniska rör för färgning celler och 12 x 75 mm rör flöde för färgning enda färg kontroller. Färgning buffert: fosfatbuffrad saltlösning (PBS) + 3% fetalt kalvserum (FCS) Pipetter Fc block (om det behövs) och antikroppar färgning. Antikroppar måste titreras för optimal färgning. Ersättning pärlor Fjädring buffert: Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) + 25 mM HEPES + 3% FCS Trypan blått och hemocytometer Cell sil (40 ìm Nylon) Insamling rör: Två typer av kollektionen rör kan användas a) 12 x 75 mm polystyren rör (som innehåller 300 l FCS och 25 mM HEPES) eller b) 15 ml koniska rör (innehållande 1 ml FCS + 25 mm HEPES). Varje rika medium med hög serumkoncentration kan användas för uppsamling av sorterade celler. Generera en enda cell uppskov med start cellpopulation. Tillval: Berika för önskad cellpopulation med en bulk reningsmetod som komplement utarmning eller magnetisk sortering. Den största fördelen med anrikning steget är att det minskar sortera tid. Tvätta cellerna gång med färgning buffert. Kassera supernatanten och suspendera cellerna i färgning buffert vid en koncentration på upp till 50 x 10 6 för effektiv färgning. Tillval: För celler som uttrycker höga nivåer av FCR, blockera receptorerna med lämplig blockering metod. En metod som föredras är att använda en mAb som binder till FcγR på is i 10-15 min. Dessa antikroppar finns kommersiellt tillgängliga. Tillsätt lämplig Mab (vid en bestämd koncentration) att färga den önskade cellen befolkningen och inkubera i 20-30 min på is i mörkret, följt av två tvättar med färgning buffert. Tillval: färgning med en viktig färg, som propidiumjodid, kan ingå att urskilja döda celler (5). Om flera färger färgning ska användas, är enda färg kontroller som krävs. Vi använder BD CompBeads att förbereda enda färg kontroller enligt tillverkarens protokollet. Om du inte använder direkt konjugerade antikroppar, upprepa steg 7 med hjälp av lämpliga sekundär antikropp eller Streptavidin konjugat. Efter tvättning, resuspendera cellerna i odlingsmedium och bestämma cellkoncentrationen med hjälp av en viktig färgämne som Trypan blå. Justera cellkoncentrationen till 15-20 x 10 6 / ml. För cellpopulationer som bildar kluster som kan täppa instrumentet under sortering, filtrera celler genom en sil. Ställ in och optimera cellen sorterare. Processen med att inrätta en flödescytometer varieras beroende på tillverkning och måste utföras av utbildad personal. De allmänna rekommendationerna är följande: Välj rätt munstycke beroende på vilken celltyp som ska sorteras. För sterila sorterar, sterilisera instrumentet. Utför styrinstrument kvalitet med pärlor för att verifiera lasrar fungerar, och det är sortering korrekt. Installera önskade samlingen enheten och ställa in sidan strömmar. Titta på instrumentets laser och detektor inrättats för att bestämma den fluorescerande etiketter som kan användas (vår BD FACS Aria har tre lasrar och kan upptäcka upp till nio färger). När det avgörs vad fluorescerande etiketter kommer att användas på cellen sorterare, kan ersättning utföras (som förklaras nedan). Utför ersättningen med negativt kontrollprov och den enda positiva kontroller. Ersättningen är nödvändigt att ta bort det spektrum överlappningen mellan två detektorer. Det är relevant att påpeka att ersättning inte är idiotsäker och påverkas negativt av hur starkt vissa markörer fläcken, och genom fluorescens av celler som har låga autofluorescens vilket kan leda till dålig upplösning mellan svagt och negativa populationer. För bästa resultat bör experimentell design inkluderar användning av ljusa fluorokromer med markörer som har låga uttryck eller som inte har en känd färgningsmönster. Markörer som ger god separation mellan cellpopulationer och är mycket uttryck bör användas med dimer fluorokromer som de upphetsade av röd eller violett laser. Ersättning kan utföras med kompensation pärlor, som är polystyren mikropartiklar som har kopplat till en antikropp som är specifik för Kappa lätta kedjan av Ig från mus, råtta eller råtta / hamster. Pärlorna är lätta att färga, har en robust signal och ett enkelt sätt att förbereda enda färgade kontroller som har samma fluoroforen som den experimentella prover. Inrätta en mall som innehåller en bivariat komplott för att visa Forward Scatter (FSC) och Side Scatter (SSC), och ett histogram förvarje fluorokrom som kommer att användas. Kör den negativa kontrollen röret och justera Forward Scatter (FSC) och Side Scatter (SSC) för att placera befolkningen i ränta på skalan. Justera fluorescens PMT-inställningarna för att placera den negativa befolkningen eller autofluorescens längst vänstra delen av histogrammet. Spela in den negativa kontrollen röret. Kör enda positiva kontroll rör och registrera data för varje rör. Rita ett intervall grind runt den positiva delen av data på histogram och annan intervall grinden på den negativa delen av histogrammet. Manuell kompensation sker genom att justera median (median är en bättre uppskattning av centrala tendenser än den genomsnittliga på en logaritmisk skala) av de positiva tills det är lika med medianen av de negativa. Detta måste göras för varje fluorokrom etiketter som används i experimentet. För att justera medianen, justera spektral överlappning värden antingen högre eller lägre tills medianerna för varje fluorescerande parameter match så nära som möjligt. Ersättning kan också göras automatiskt med analysprogram. Automatisk kompensation använder de registrerade uppgifterna från ersättning kontroller för att beräkna ett algebraiskt matris för alla fluoroforer som används i experimentet. Dessa värden används för att dra ut bidragen från det icke-primära färger som blöder in i en primär färg är detektor. Spela in den experimentella prov som ska sorteras och använda gating verktyg och delmängder av metoder för att definiera populationer av intresse. Ställ in den experimentella mallen med en punkt plot som visar FSC-mot SSC och använda en slussning verktyg, polygon, rektangel, intervall eller kvadranten till gate befolkning av intresse. Den spridningsdiagram visar de fysiska egenskaperna hos den cell som skiljer den celltyp. Det bästa sättet att bestämma fluorescens gating strategi är att använda fluorescens minus ett (FMO) kontroller. I en FMO kontrollrör alla reagenser som används i experimentet ingår förutom ett av intresse. Den FMO hjälper diskriminerar mellan svagt färgade populationer och bred negativa populationer. Använd de uppgifter som registrerats från FMO rör att avgöra var att sätta grindar inom experimentell röret. När portarna har fastställts, kan portarna väljas för sortering i externa samling rör. Upp till fyra portar (eller populationer) kan sorteras på en gång beroende på instrumenteringen finns. Kör experimentella provröret vid 4 ° C, slå på nedböjning tallrikar, och sortera provet. 5 x 10 5 -1,5 x 10 6 celler kan sorteras in i en 12 x 75 mm rör och 1,5 x 10 6 – 4,5 x 10 6 celler kan sorteras in i en 15 ml konisk. När rätt antal celler har erhållits, manuellt stoppa sortering. Gör en post-sorts analys för att fastställa renheten hos den sorterade cellpopulationer. Representativa resultat Vi har visat här resultaten för mus mjälten B och CD4 T-cell sortering (Figur 1). Splenocytes färgades med PE Texas Red-konjugerat anti-mus B220, FITC-konjugerat anti-mus TCRβ och Alexafluor-700-konjugerat anti-mus CD4 att identifiera B-celler (B220 + TCRβ-) och CD4 T-celler (CD4 + TCRβ + ). Sorteringen utfördes med BD FACS Aria instrument. Efter sortering av B-celler renhet var> 97% och CD4 T celler renhet var> 98%. Figur 1. Renhet av mjälten B-celler och CD4 T-celler efter FACS. Pigg splenocytes färgades med anti-mus-B220, TCRβ och CD4 antikroppar. FACS för B-celler genomfördes med en BD FACS Aria genom gating på B220 + TCRβ-celler (Fig. 1A, till vänster, nedre högra kvadranten). En post sorts analys utfördes för att fastställa renheten hos B-celler (Fig. 1A, högra panelen). B220 färgning visas på x-axeln och TCRβ färgning på y-axeln. FACS för CD4 T-celler utfördes med samma flödescytometer av gating på TCRβ + CD4 + celler (Fig. 1B, vänstra panelen övre högra kvadranten). En post sorts analys utfördes för att bestämma renhet CD4 T-celler (Fig. 1B, högra panelen). TCRβ färgning visas på x-axeln och CD4 färgning på y-axeln. Andelen positiva celler i varje kvadrant visas. <!– Figur 2. Renhet av mjälten CD4 T-celler efter FACS. Murine mjälten T-celler har berikats av borttagning av B-celler genom att panorera. Därefter var celler färgade med anti-mus TCRβ och CD4-antikropp (till vänster). FACS genomfördes med en BD FACS Aria genom gating på TCRβ + CD4 + celler (vänstra panelen övre högra quadrANT). En post sorts analys utfördes för att bestämma renhet T-celler, som var större än 99% (högra panelen). TCRβ färgning visas på x-axeln och CD4 färgning på y-axeln. Andelen positiva celler i varje kvadrant visas. ->

Discussion

FACS är en mycket avancerad teknik för att rena cellpopulationer av intresse, där en mycket hög renhet (95-100%) av det sorterade befolkningen kan erhållas. Därför är denna teknik särskilt viktigt för experiment, där hög renhet är ett grundläggande krav (t.ex. microarray analys). FACS är särskilt fördelaktigt jämfört med andra tillgängliga metoder för rening när en cell population måste renas baseras på ett uttryck vecka yta markör eller när två eller flera populationer måste renas som har olika uttryck för samma yta markör. Till exempel rening av marginella zon B-celler (B220 ⁺ CD21 ^hi CD23 ^{int / låg)} och follikulärt B-celler (B220 ⁺ CD21 ^{int / låg} CD23 ^hi) baserat på uttryck nivåer av CD21 och CD23. Ett annat växande tillämpning av FACS är enda cell sortering gör en analys av enskilda celler (3, 4). FACS är också vanligt att sortera celler som uttrycker fluorescerande proteiner som är genetiskt uttryck, såsom gröna fluorescerande proteinet taggade proteiner (5). Om en steril sortera utförs cellerna kan odlas. Däremot kan cellviabiliteten och avkastningen äventyras under sorteringen. Lönsamheten kan förbättras med hjälp av en cell beroende optimala temperaturen för sortering och genom att bearbeta Uppsamlingsrör omedelbart efter de når kapacitet. Återhämtning kan ökas genom att använda rör av polypropylen insamling, samla sorterade celler i serum rik media och vända rören samling intermittent, underhålla samlingen rör vid en optimal temperatur och centrifugering sorteras celler för ~ 10 min (http://cyto.mednet.ucla.edu / Protocol.htm).

Utvecklingen av ultrahög hastighet sorterare har utökat möjligheten att tillämpningen av flödet sortering i kliniska situationer. Den eventuella kliniska tillämpningar av FACS inkluderar rening av blodstamceller från mänskligt blod för terapeutiska syften, applikationer inom cancerterapi, fostervattensprov ersättning, sortering mänskliga spermier och tidig detektion sjukdom (6, 7).

För multicolor färgning är antikropp välja ett kritiskt steg och fluorokromer väljs bygger på att upptäcka för varje enskilt instrument. Det finns ett antal företag som säljer cell sorterare och laser konfiguration varierar beroende på användarnas behov. Således kan man inte helt enkelt använda exakt samma antikroppar används i publicerade studier utan att bekräfta kompatibilitet. För optimal antikropp val, bör man överväga uttrycket nivån av proteinet som undersöks. I allmänhet bör den ljusaste som finns fluorokrom-märkta antikroppar användas för att färga dunkelt uttryckt ytan markörer, medan dim fluorokromer kan användas för färgning av hög grad uttryckt ytan markörer (8). Dessutom bör antikroppar väljas på ett sådant sätt som överlappar bland sina emissionsspektra är minimal. För multicolor färgning är det mycket svårt att välja fluorokrom som inte har någon spektral överlappning. I denna situation är ersättning utförs.

Ersättning krävs för att matematiskt eliminera fluorescens överlappning mellan utsläpp spektrum av de olika fluorokromer som är mätbara med detektorer (8-10). Med andra ord är den överlappning fluorescens från ett fluorokrom subtraheras från utsläpp spektrum av annan fluorokrom. Ersättningen Beräkningen förutsätter en ofärgade kontroll och enda positiva kontroller för varje fluorokrom användas för en mångfärgad färgning (9, 10). Ersättning kan utföras med hjälp av celler eller pärlor. Pärlorna är lätta att färga, har en robust signal och ett enkelt sätt att förbereda enda färgade kontroller som har samma fluoroforer som den experimentella prover. Ersättning pärlor är särskilt fördelaktigt när cellytan proteinet av intresse uttrycks på en låg nivå och när cellpopulation begränsar i den inledande start cellpopulation.

När antikroppar har valts, bör deras verksamhet kan optimeras genom att utföra en titrering analys. Detta är särskilt viktigt om FACS maskinen har mycket kraftfulla lasrar. Användningen av suboptimala koncentrationer av färgning antikroppar kan leda till dålig separation av den önskade cellen befolkningen från den totala cellpopulation. Användning av höga antikroppskoncentration ökar chansen för antigen icke-specifik färgning. Därför antikroppstiter kommer att tillåta val av antikroppskoncentrationen som ger den maximala ljusstyrkan på positiva befolkningen och minimal bakgrundsfärgning (8).

FACS är nu en standardiserad teknik för rening av subpopulationer av celler. Den kan användas för att separera alla celltyper i vilka en cellsuspensionen kan genereras och antikroppar är tillgängliga för att identifiera den önskade cellen befolkningen. FACS är den metod som föredras när highly rena cellpopulationer behövs.