Desde que James Thomson et al desenvolveram uma técnica em 1998 para isolar e cultivar-tronco embrionárias humanas em cultura, as células de congelamento para uso posterior e descongelamento e expandir as células de um estoque de congelados tornaram-se procedimentos importantes realizados em cultura de rotina CTeh. Como as células-tronco embrionárias humanas são muito sensíveis ao estresse de congelamento e descongelamento, cuidados especiais devem tomadas. Aqui nós demonstrar a técnica adequada para rapidamente descongelamento CTeh de stocks nitrogênio líquido, plaqueamento em células embrionárias de rato de alimentação, e, lentamente, congelá-los para o armazenamento de longo prazo.
Desde que James Thomson<em> Et al</em> Desenvolveu uma técnica em 1998 para isolar e cultivar-tronco embrionárias em cultura, as células de congelamento para uso posterior e descongelamento e expandir as células de um estoque de congelados tornaram-se procedimentos importantes realizados em cultura de rotina CTeh. Como as células-tronco embrionárias humanas são muito sensíveis ao estresse de congelamento e descongelamento, cuidados especiais devem tomadas. Aqui nós demonstrar a técnica adequada para rapidamente descongelamento CTeh de stocks nitrogênio líquido, plaqueamento em células embrionárias de rato de alimentação, e, lentamente, congelá-los para o armazenamento de longo prazo.
O vídeo que acompanha demonstra um método para descongelar e congelar células-tronco embrionárias humanas. Células congeladas em nitrogênio líquido devem ser descongeladas banho o mais rápido possível para obter a melhor recuperação possível. Lembre-se de ser extremamente cuidadoso ao pipetar células descongelamento: minimizar o manuseio das células e pipeta suavemente. Um frasco de células-tronco embrionárias humanas podem ser semeados em qualquer um poço de uma placa 6-bem, ou todos os poços de uma placa de 4 bem e imediatamente colocado na incubadora. Uma vez que o cultivo em quatro poços separados reduz a possibilidade de perder toda a cultura à contaminação, e torna mais fácil para localizar as colônias de células-tronco embrionárias humanas na superfície menor, a placa de 4 bem é recomendado quando o descongelamento de células-tronco embrionárias humanas, pela primeira vez.
O primeiro dia após o descongelamento de células-tronco embrionárias humanas, as colónias são pequenas e podem ser transparentes. Reabastecer o meio de cultura de células-tronco embrionárias humanas a cada dia, mesmo que as colônias não são aparentes sob o microscópio, pois pode levar alguns dias em cultura de células-tronco embrionárias humanas para aparecer como colônias estabelecidas. É importante usar uma camada de alimentador de recém-banhado MEF quando descongelar as células, como as colônias muitas vezes não chegar a um tamanho adequado para até 10 passaging 12 dias após o degelo.
Quando descongelar um frasco de passagem baixa de células-tronco embrionárias humanas, é uma boa prática para expandir e congelar os frascos adicionais para manter um estoque de células passagem baixa para a cultura e as experiências futuras. Também é uma boa idéia rotineiramente congelar todos os "extras" células-tronco embrionárias humanas saudáveis para manter estoques congelados. O degelo de maior sucesso e culturas subseqüentes foram congelados de alta qualidade, indiferenciado, colônias de células-tronco embrionárias humanas dividindo ativamente. células-tronco embrionárias humanas se recuperar de um congelamento de forma mais eficiente se for manuseada com cuidado como agregados maiores celular. O tamanho final global deve ser semelhante (ou ligeiramente maior do que) o tamanho dos agregados banhado depois de uma passagem de rotina.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
D-MEM | Invitrogen | 11965-092 | For MEF mediumjavascript:void(0); | |
Fetal Bovine Serum (FBS), Certified | Invitrogen | 16000-044 | Heat-inactivated For MEF medium |
|
D-MEM/F-12 | Invitrogen | 11330-057 | ||
Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | Pre-screen to ensure support of hES cells | |
bFGF | Stemgent | 03-0002 | Use at [4 ng/mL] final | |
Non-essential Amino Acids | Invitrogen | 11140-050 | ||
L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | 200 mM (100X) Use at [1X] final |
|
PBS | Invitrogen | 14190-250 | Without Ca2+ or Mg2+ | |
Collagenase IV | Invitrogen | 17104-019 | Make a fresh solution at 1 mg/mL in D-MEM/F-12 | |
Gelatin | Sigma | G1890 | Type A, Porcine | |
DMSO | Sigma | D2560 | For freezing medium | |
Fetal Bovine Serum (FBS), Defined | HyClone | SH300.70.01 | For freezing medium | |
6-well plates | Nunc | 140675 | For general culture | |
4-well plates | Nunc | 176740 | For thawing | |
5 mL glass pipettes | Fisher | 13-678-27E | Individually wrapped | |
15 mL conical tubes | Corning | 430052 | Polypropylene | |
Cryogenic vials | Nunc | 5000-1020 | 1.5 mL capacity | |
Freezing container | Nalgene | 5100-0001 | “Mr. Frosty” |