Dissociated वयस्क स्तनधारी न्यूरॉन्स में डीएनए की Intranuclear Microinjection

Summary

सीडीएनए के प्रत्यक्ष intranuclear इंजेक्शन बाद mitotic कोशिकाओं के लिए एक प्रभावी तकनीक अभिकर्मक है. इस विधि एकल या एकाधिक सीडीएनए constructs से heterologous प्रोटीन अभिव्यक्ति के उच्च स्तर प्रदान करता है और एकल कक्ष assays के एक किस्म के साथ एक physiologically प्रासंगिक वातावरण में अध्ययन किया जा प्रोटीन समारोह में सक्षम बनाता है.

Abstract

प्राथमिक neuronal सेल संस्कृतियों मूल्यवान उपकरण हैं करने के लिए प्रोटीन समारोह का अध्ययन के बाद से वे अमर सेल लाइनों की तुलना में एक अधिक प्रासंगिक जैविक प्रणाली का प्रतिनिधित्व करते हैं. हालांकि, बाद mitotic प्राथमिक न्यूरॉन्स की प्रकृति electroporation या रासायनिक मध्यस्थता अभिकर्मक के रूप में आम प्रक्रियाओं का उपयोग करते हुए प्रभावी heterologous प्रोटीन अभिव्यक्ति को रोकता है. इस प्रकार, अन्य तकनीकों के क्रम में प्रभावी ढंग से इन गैर विभाजित कोशिकाओं में प्रोटीन व्यक्त करने के लिए नियोजित किया जाना चाहिए.

इस अनुच्छेद में, हम अलग वयस्क सहानुभूति न्यूरॉन्स में सीडीएनए constructs के intranuclear इंजेक्शन प्रदर्शन के लिए आवश्यक कदम का वर्णन. इस तकनीक है, जो न्यूरॉन्स के विभिन्न प्रकार के लिए लागू किया गया है सफलतापूर्वक heterologous प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रेरित कर सकते हैं. microinjection प्रक्रिया के लिए आवश्यक उपकरण एक औंधा माइक्रोस्कोप कोशिकाओं, सीडीएनए समाधान है कि एक एन _{2 (छ)} दबाव वितरण प्रणाली से जुड़ा है के साथ भरा एक गिलास इंजेक्शन pipet, और एक micromanipulator कल्पना भी शामिल है . micromanipulator दबाव एन ₂ की एक संक्षिप्त पल्स सीडीएनए समाधान pipet सिरे से बेदखल करना microinjection pipet के इंजेक्शन गति निर्देशांक.

इस तकनीक को कई अन्य अभिकर्मक तरीकों के साथ जुड़े विषाक्तता नहीं है और कई डीएनए constructs करने के लिए सक्षम बनाता है एक सुसंगत अनुपात में व्यक्त किया जा. इंजेक्शन कोशिकाओं की कम संख्या microinjection प्रक्रिया अच्छी तरह electrophysiological रिकॉर्डिंग और ऑप्टिकल इमेजिंग के रूप में एकल कोशिका के अध्ययन के लिए उपयुक्त बनाता है, लेकिन जैव रासायनिक assays कि कोशिकाओं और उच्च अभिकर्मक क्षमता की एक बड़ी संख्या की आवश्यकता के लिए आदर्श नहीं हो सकता. हालांकि intranuclear microinjections उपकरण और समय के निवेश की आवश्यकता है, एक physiologically प्रासंगिक वातावरण में heterologous प्रोटीन अभिव्यक्ति के उच्च स्तर को प्राप्त करने की क्षमता इस तकनीक प्रोटीन समारोह की जांच के लिए एक बहुत ही उपयोगी उपकरण बना देता है.

Protocol

इंजेक्शन के लिए मैं तैयार यह खंड तैयारी चरणों का वर्णन करता है कि से पहले न्यूरॉन्स के नाभिक में सीडीएनए इंजेक्शन लिया जाना चाहिए. न्यूरॉन्स के लिए अलगाव की प्रक्रिया इस लेख के दायरे से परे है, लेकिन यह महत्वपूर्ण है कि व्यक्ति की कोशिकाओं में अलग न्यूरॉन्स और 35 मिमी सेल संस्कृति व्यंजन के नीचे सतह के लिए अच्छी तरह से पालन (इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए उपयोगी सुझावों के लिए चर्चा देखें). हालांकि विभिन्न न्यूरॉन्स की एक किस्म के संभावित इस्तेमाल किया जा सकता है, जैसे बेहतर ग्रीवा (एससीजी) ganglia या पृष्ठीय रूट ganglia परिधीय ganglia विच्छेदन के लिए पसंद कर रहे हैं क्योंकि वे आसानी से सुलभ हैं और न्यूरॉन्स की एक बड़ी संख्या उपज. एससीजी न्यूरॉन्स का उपयोग करने का अतिरिक्त लाभ कर रहे हैं कि वे कोशिकाओं की एक अपेक्षाकृत समरूप जनसंख्या रहे हैं और 1,2,3,4 अच्छी तरह से विशेषता है. प्लाज्मिड के ए तैयार इंजेक्शन के लिए सीडीएनए संदूषण या डीएनए के टूटने को रोकने के लिए, दस्ताने की तैयारी के दौरान पहना होना चाहिए. ब्याज की प्रोटीन एन्कोडिंग डीएनए एक उपयुक्त PCI (Promega, मैडिसन, WI) जैसे स्तनधारी अभिव्यक्ति वेक्टर, अत्यधिक और constitutively सक्रिय cytomegalovirus प्रमोटर (सीएमवी) के नियमन के तहत, में subcloned है. यदि प्रोटीन लेबल नहीं है, एक प्लाज्मिड संवाददाता, उदाहरण के लिए एन्कोडिंग EGFP (pEGFP-N1, बी.डी. बायोसाइंसेज Clontech, Palo Alto, CA), सफल इंजेक्शन और अभिव्यक्ति की पुष्टि सह इंजेक्शन. डीएनए एक उच्च गुणवत्ता जुदाई स्तंभ (जैसे QIAfilter Midi-प्रस्तुत करने किट, Qiagen, Chatsworth, CA के) और आगे शुद्ध PVDF फिल्टर (0.1 सुक्ष्ममापी, Millipore, Bedford, MA) के साथ एक केन्द्रापसारक फिल्टर यूनिट का उपयोग में particulates हटायें का उपयोग करने के लिए अलग है प्लाज्मिड तैयारी, जो इंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान इंजेक्शन pipets में बाधा डालती कर सकते हैं. प्लास्मिड -20 ° सी में लगभग 1 μg / μl की एकाग्रता में एक उपयुक्त डीएनए भंडारण बफर (: 10 मिमी Tris, 1 मिमी EDTA, 8.0 पीएच जैसे ते बफर) में संग्रहीत हैं. तुरंत microinjection करने से पहले, प्लाज्मिड cDNAs पतला और ते बफर या एच 2 ओ में वांछित अंतिम एकाग्रता के लिए मिश्रित आमतौर पर, 5-10 एनजी / रिपोर्टर जीन की μl इंजेक्शन कोशिकाओं लेबल करने के लिए पर्याप्त है, और इंजेक्शन हो सीडीएनए की कुल एकाग्रता 200 एनजी / μl से अधिक नहीं के बाद से उच्च सांद्रता में डीएनए चिपचिपा है और इंजेक्शन pipets रोकना कर सकते हैं चाहिए. इंजेक्शन के लिए एक सीडीएनए की छोटी मात्रा (5-10 μl) Parafilm (कागज समर्थन नीचे की ओर) का एक छोटा सा टुकड़ा की साफ सतह पर समाधान का मिश्रण बूँदें द्वारा तैयार की है. समाधान की बूंदों के साथ ऊपर और नीचे pipeting pipetor के साथ कई बार और मिक्स मिश्रण के दौरान हवाई बुलबुले शुरू करने से बचें. एक microloader pipet टिप (Eppendorf, Brinkmann उपकरण, Westbury, NY) का उपयोग करना, एक विशेष रूप से तैयार हेमाटोक्रिट ट्यूब (फिशर साइंटिफिक, पिट्सबर्ग, फिलीस्तीनी अथॉरिटी) के लिए सीडीएनए समाधान हस्तांतरण. हेमाटोक्रिट ट्यूब (सामग्री तालिका) की तैयारी पर निर्देश के लिए सामग्री अनुभाग देखें. हेमाटोक्रिट एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में सीडीएनए इंजेक्शन समाधान युक्त ट्यूब रखें. 10 एक एक निश्चित कोण या झूल बाल्टी रोटर (Eppendorf) के साथ सुसज्जित microcentrifuge में 000 ग्राम में 15-30 मिनट के लिए कमरे के तापमान (20-24 ° सी) सीडीएनए समाधान में तलछट कणों कि ब्लॉक कर सकते हैं पर ट्यूब, अपकेंद्रित्र pipet microinjection. सीडीएनए इंजेक्शन समाधान इंजेक्शन सत्र के दौरान कमरे के तापमान पर रखा जा सकता है. इंजेक्शन pipets बी निर्माण डिस्पोजेबल गिलास microinjection pipets व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं (जैसे Femtotips, Eppendorf) है, जो सुविधाजनक है, लेकिन महंगा ($ 10 प्रति microinjection pipet) हैं. इंजेक्शन pipets एक प्रोग्राम पी 97 ज्वलंत ब्राउन pipet (Sutter साधन कंपनी, Novato, CA) खींचने और filamented, पतली दीवारों borosilicate ग्लास केशिका ट्यूब (विश्व परिशुद्धता उपकरण, Sarasota, FL) का उपयोग कर प्रयोगशाला में निर्मित किया जा सकता है. यह विकल्प अधिक लागत प्रभावी है और microinjection pipet आकार और आकार के नियंत्रण के लिए अनुमति देता है. एक दो चरण कार्यक्रम संकीर्ण microinjection pipet सुझावों खींच करने के लिए प्रयोग किया जाता है. Microinjection pipets के उद्घाटन के बाद भी एक रोशनी खुर्दबीन के तहत जांच के लिए संकीर्ण है, इंजेक्शन pipets की गुणवत्ता को सीधे पहले प्रोग्राम सेटिंग्स को अंतिम रूप दे रहे हैं कुछ कोशिकाओं को इंजेक्शन के द्वारा मूल्यांकन किया जाना है. निम्नलिखित गर्मी, पुल, वेग, और समय सेटिंग्स के लिए अनुमानित सेटिंग्स हैं: (खींच 1) 600, 115, 15, 250; (2 पुल) 640, 130 और 65, 200. ये सेटिंग्स कांच के विभिन्न बैचों के साथ और खींचने में हीटिंग फिलामेंट की हालत के हिसाब से बदलती है, और जरूरत के रूप में समायोजित किया जाना चाहिए. अधिक जानकारी के लिए 5 देखते हैं. कई (2-5) न्यूरॉन्स के पकवान प्रति इंजेक्शन pipets, क्षति या इंजेक्शन सत्र के दौरान समस्याओं के मामले में इंजेक्शन जा खींचो. एक कवर कंटेनर में स्टोर इंजेक्शन pipets microinjection pipet टिप में प्रवेश करने से धूल को रोकने. द्वितीय. Intranuclear microinjection तम्बू "> यह खंड न्यूरॉन्स के नाभिक में सीडीएनए इंजेक्शन की प्रक्रिया के विवरण एक बुनियादी microinjection सेट अप एक औंधा चरण विपरीत (जैसे Nikon Diaphot TMD, Nikon, मेलविल, एनवाई) खुर्दबीन प्रक्रिया कल्पना, micromanipulator (शामिल हैं जैसे Eppendorf 5171) इंजेक्शन pipet के आंदोलन और एक दबाव सुई लगानेवाला (जैसे Eppendorf FemtoJet एक्सप्रेस) को नियंत्रित करने के लिए pipet से सीडीएनए समाधान निष्कासित. micromanipulator दबाव सुई लगानेवाला कनेक्ट इंजेक्शन के दौरान बाद के दो प्रक्रियाओं के तुल्यकालन के लिए अनुमति देता है अन्य. वैकल्पिक है, लेकिन अत्यधिक की सिफारिश की, घटकों आरोहित वीडियो निगरानी प्रणाली (सीसीडी कैमरा, Cohu इंक, सैन डिएगो, सीए, काले और सफेद वीडियो मॉनीटर, सोनी निगम, टोक्यो, जापान) में शामिल हैं इस प्रणाली के इंजेक्शन के लिए एक पूर्ण आवश्यकता नहीं है. तथापि, काले और सफेद निगरानी सेल नाभिक के बेहतर दृश्य के लिए उच्च विपरीत प्रदान करता है और एक और अधिक आरामदायक लंबे इंजेक्शन सत्र के दौरान देखने का अनुभव प्रदान करता है इसके अलावा, एक लैपटॉप कंप्यूटर सॉफ्टवेयर चलाने के लिए एक हाथ से आयोजित नियंत्रक संचालित अर्द्ध उपयोग किया जा सकता है. इंजेक्शन प्रक्रिया को स्वचालित (विवरण के लिए चर्चा देखें). एससीजी न्यूरॉन्स इंजेक्षन करने के लिए आदर्श समय 3-6 घंटे बाद हदबंदी है. इस स्तर पर, कक्षों गोलाकार कर रहे हैं, कसकर पकवान के नीचे करने के लिए संलग्न है, और स्पष्ट रूप से दिखाई दे नाभिक है, चरण विपरीत एक खुर्दबीन के तहत, एक अंधेरे झिल्ली के साथ एक केंद्रीय दौर organelle के रूप में, एक एकल या एकाधिक (nucleoli चित्रा युक्त 1 ए). Dissociated न्यूरॉन्स की खुर्दबीन मंच के केंद्र पर एक डिश रखें. ध्यान समायोजित और माइक्रोस्कोप के चरण विपरीत प्रकाशिकी अनुकूलन है तो न्यूरॉन्स के नाभिक स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं. Pipet एक microinjection microloader pipet टिप का उपयोग pipet में तैयार सीडीएनए समाधान के 2 μl. हेमाटोक्रिट ट्यूब के नीचे के पास समाधान ड्राइंग के बाद से इस particulates कि centrifugation के दौरान बसे हलचल कर सकते से बचें. microinjection pipets में फिलामेंट टिप करने के लिए हल ड्राइंग में सहायता करना चाहिए, लेकिन अगर छोटे हवाई बुलबुले जारी रहती है तो धीरे कांच के पक्ष झटका उन्हें बेदखल. Microinjection pipet दबाव सुई लगानेवाला के केशिका धारक में डालें और फिर micromanipulator के लिए धारक सुरक्षित. धारक एक 45 ° कोण पर तय हो गई है. लोअर पकवान में microinjection pipet. के रूप में pipet संस्कृति माध्यम में प्रवेश करती है, एक meniscus बनाई है कि प्रकाश के अपवर्तन को प्रभावित करता है और न्यूरॉन्स की छवि गुणवत्ता को कम करती है. इस समस्या को कम करने के लिए, चरण अंगूठी बुर्ज थोड़ा न्यूरॉन्स के नाभिक तक स्पष्ट रूप से दिखाई दे फिर रहे हैं भरपाई कर सकते हैं. कुछ दबाव इंजेक्शन प्रणाली एक "साफ" समारोह है कि एक छोटी अवधि के लिए microinjection pipet सिरे से अधिकतम हवा का दबाव लागू होता है. इस फ़ंक्शन का उपयोग करने के लिए शुरुआत से पहले और इंजेक्शन के दौरान अगर टिप भरा दिखाई देता है मलबे के pipet स्पष्ट. यदि dispelled द्रव स्क्रीन पर दिखाई नहीं है, जबकि इस समारोह का उपयोग कर एक नया इंजेक्शन pipet के साथ जगह. केंद्र देखने की निगरानी में microinjection pipet और एक न्यूरॉन के पास और nucleolus के रूप में एक ही फोकल हवाई जहाज़ में टिप संरेखित. Micromanipulator पर कम सीमा z-अक्ष के रूप में इस स्थिति को सेट करें. इस स्थिति में गहराई microinjection pipet इंजेक्शन के दौरान अग्रिम जाएगा है. अब लगभग 30 सुक्ष्ममापी इस बिंदु ऊपर टिप स्थिति इतनी microinjection pipet न्यूरॉन्स के शीर्ष को साफ करता है. निम्नलिखित सेटिंग्स के साथ एक Eppendorf 5171 micromanipulator के मोड "इंजेक्षन" परिभाषित किया जा सकता है intranuclear इंजेक्शन प्रदर्शन. समारोह इंजेक्षन पर सेट कर दिया जाता है, whilst कोचना समारोह से दूर छोड़ दिया है . एक विकर्ण इंजेक्शन पथ (एक्स और z-अक्ष के साथ) कोशिका क्षति कम से कम राशि का उत्पादन है, और इस प्रकार अक्षीय मोड इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. 300 सुक्ष्ममापी / एस का एक इंजेक्शन की गति पर्याप्त है, और दबाव सिंक्रनाइज़ निर्माण जब microinjection pipet सेट z-अक्ष की सीमा तक पहुँचता है. दबाव सुई लगानेवाला सीडीएनए नाभिक में इंजेक्शन समाधान की मात्रा को नियंत्रित करता है. "स्वत:" इंजेक्शन मोड में, डीएनए की डिलीवरी समय नियंत्रित और जुड़ा micromanipulator द्वारा शुरू की है. इंजेक्शन दबाव (Pi) में 100 से 200 hectopascals (1 इंच ~ 0.015 साई एचपीए), के बीच स्थापित किया जाना चाहिए उच्च इंजेक्शन इंजेक्शन के दबाव सफलता दरों या गुणवत्ता में सुधार नहीं करते हैं और microinjection pipet टिप आकार या शुद्धता डीएनए के साथ अन्य समस्याओं का संकेत हो सकता है . 0.3 एस के एक इंजेक्शन (ती) की अवधि और 30 इंच है, जो एक निरंतर सकारात्मक pipet टिप में संस्कृति के माध्यम से कणों occluding का प्रवेश से बचने के दबाव की आपूर्ति की मुआवजा दबाव (पीसी), प्रयोग किया जाना चाहिए. स्थिति न्यूरॉन microinjection pipet की खुर्दबीन मंच xy अक्ष नियंत्रण का उपयोग टिप के तहत इंजेक्शन जा. टी के बीच आगे और पीछे ध्यान केंद्रित करके नाभिक के केन्द्र से ऊपर pipet की नोक संरेखित करेंवह टिप और nucleoli. बटन इंजेक्षन (micromanipulator पर) दबाकर नाभिक इंजेक्षन. इंजेक्शन कदम के लिए, microinjection pipet और सीडीएनए समाधान के रिलीज के आंदोलन micromanipulator द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं. यह आंख से सफल intranuclear इंजेक्शन की पुष्टि करना मुश्किल है, लेकिन अपेक्षाकृत कम चिपचिपापन सीडीएनए समाधान के इंजेक्शन (चिपचिपा परमाणु पर्यावरण के लिए तुलना में), अक्सर चरण विपरीत प्रकाशिकी के तहत एक सफेद पंख के रूप में प्रकट होता है और इंजेक्शन के एक संकेतक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है नाभिक में. कभी कभी microinjection pipet परमाणु झिल्ली घुसना नहीं करता है और बस नाभिक nudges. एक ही स्थान पर एक दूसरे इंजेक्शन प्रयास नाभिक में एक डीएनए के सफल इंजेक्शन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. सेल की सूजन आमतौर पर unintentional cytoplasmic इंजेक्शन का संकेत है. इसके अलावा, महत्वपूर्ण परमाणु सूजन अच्छी तरह से न्यूरॉन्स और कोशिका मृत्यु में आमतौर पर परिणाम द्वारा नहीं सहन किया है जल्द ही बाद में, इस प्रकार, इंजेक्शन के दबाव और अवधि का सुझाव दिया मूल्यों अधिक नहीं होनी चाहिए. खुर्दबीन मंच repositioning microinjection pipet के तहत अगले न्यूरॉन संरेखित द्वारा न्यूरॉन्स इंजेक्शन जारी रखें. व्यवस्थित डिश के माध्यम से नेविगेट करने के लिए इनक्यूबेटर करने के लिए रातोंरात ऊष्मायन के लिए न्यूरॉन्स के पकवान लौटने से पहले लगभग 50-100 नाभिक इंजेक्षन. सफलतापूर्वक इंजेक्शन न्यूरॉन्स अगले दिन रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति के द्वारा की पहचान कर सकते हैं. III. प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 1: सुपीरियर ग्रीवा नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स (एससीजी). चरण न्यूरॉन्स एससीजी के विपरीत छवि 3 घंटे पोस्ट पृथक्करण (ए). इस अवस्था में, नाभिक स्पष्ट रूप से दिखाई है जो microinjection pipet टिप के संरेखण एड्स है. नाभिक (बाएं) एकल या एकाधिक (दाएं) अंधेरे nucleoli के साथ न्यूरॉन्स के केंद्र में दिखाई देता है. 16 घंटे न्यूरॉन्स नाभिक (बी) में सीडीएनए EGFP के इंजेक्शन के बाद एससीजी. बाएँ, चरण विपरीत रोशनी के तहत देखा न्यूरॉन्स एससीजी. ठीक है, वही सफल इंजेक्शन दिखा और एक न्यूरॉन में EGFP अभिव्यक्ति परिणामस्वरूप न्यूरॉन्स की epifluorescent छवि. व्हाइट पैमाने बार 20 सुक्ष्ममापी है. चित्रा 2: के माध्यम से पूरे सेल धाराओं के रिकॉर्डिंग heterologously-व्यक्त जी प्रोटीन भीतर न्यूरॉन्स एससीजी से कश्मीर + चैनल (GIRK) सुधार करने के लिए युग्मित. GIRK धाराओं (मैं GIRK) एक 200 एमएस वोल्टेज -140 से -60 एम वी के एक होल्डिंग क्षमता से 40 mV रैंप (एक के इनसेट) norepinephrine द्वारा अंतर्जात α 2-adrenoceptors निम्नलिखित सक्रियण (पूर्वोत्तर, 10 सुक्ष्ममापी) के द्वारा पैदा किया गया . आरोपित निशान ही न्यूरॉन से रिकॉर्डिंग कर रहे हैं और (काला) पहले और बाद या तो पूर्वोत्तर (नीला) अकेले या पूर्वोत्तर के आवेदन से अधिक 10 मिमी 2 बा (लाल) + संकेत मिलता है. डैश्ड लाइनों शून्य मौजूदा स्तर से संकेत मिलता है. मैं GIRK, बाहरी समाधान निहित (मिमी में) 130 NaCl, 5.4 KCl, 10 HEPES, 10 2 CaCl, 0.8 2 MgCl, 15 ग्लूकोज, 15 sucrose, और TTX .0003, NaOH के साथ 7.4 पीएच को समायोजित रिकॉर्डिंग के लिए . आंतरिक रिकॉर्डिंग समाधान (मिमी में) KCl 135, 11 EGTA, 1 2 CaCl, 2 2 MgCl, 10 HEPES, 4 MgATP और ना 0.3 2 GTP, KOH के साथ 7.2 पीएच को समायोजित. वर्तमान की कमी uninjected एससीजी न्यूरॉन्स में पूर्वोत्तर की उपस्थिति में वोल्टेज रैंप द्वारा हासिल (ए) यह दर्शाता है कि एससीजी न्यूरॉन्स अंतर्जात GIRK चैनलों व्यक्त नहीं करते. प्लाज्मिड सीडीएनए एन्कोडिंग एक कार्यात्मक GIRK 11 चैनल के सफल इंजेक्शन वोल्टेज रैंप के दौरान बड़ी धाराओं को जन्म देता है जब पूर्वोत्तर (बी, बाएं) को उजागर. जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर (पूर्वोत्तर) agonist, आवक परिहार, और ख्यात GIRK चैनल ब्लॉकर, बा + 2 (बी, सही लाल ट्रेस) द्वारा धाराओं के ब्लॉक से सक्रियण: धाराओं GIRK चैनलों के माध्यम से धाराओं के विशिष्ट विशेषताओं है. खोलें और भरे हलकों का प्रतिनिधित्व करते हैं मैं पकड़ और मौजूदा शिखर पर GIRK , क्रमशः. कृपया यहाँ क्लिक करें आंकड़ा 2 का एक बड़ा संस्करण देख.

Discussion

आम समस्याओं का सामना करना पड़ा और सुझाव:

जैसा कि पहले उल्लेख सफल परमाणु इंजेक्शन टिशू कल्चर प्लेटों के अनुयायी कोशिकाओं होने पर निर्भर करते हैं. इंजेक्शन के शुरू स्थगित कुछ घंटे सेल पृथक्करण प्रक्रिया निम्नलिखित न्यूरॉन्स बर्तन के नीचे का पालन करने के लिए अनुमति देता है. इसके अलावा, 0.1 मिलीग्राम / उच्च आणविक भार (सिग्मा, सेंट लुइस, MO) पाली एल lysine एड्स व्यंजन के नीचे की सतह के लिए न्यूरॉन्स के आसंजन के मिलीलीटर के साथ कोटिंग व्यंजन.

Microinjection pipets की रुकावट, खासकर जब डीएनए के एक उच्च एकाग्रता इंजेक्षन करने का प्रयास, एक लगातार समस्या हो सकती है. उच्च गुणवत्ता जुदाई स्तंभों का उपयोग प्लास्मिड डीएनए को अलग करने और शुद्ध, और अतिरिक्त शुद्धि उल्लेख किया है (स्पिन फिल्टर, हेमाटोक्रिट ट्यूबों में कताई) कदम प्रदर्शन particulates हटाने के इंजेक्शन लगाने के लिए पहले की मदद कर सकते हैं. इंजेक्शन के दौरान दबाव सुई लगानेवाला के "स्वच्छ" समारोह (0.2 एस के लिए पर्याप्त है) का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन है कि यदि समस्या हल नहीं होती, एक नया इंजेक्शन pipet इस्तेमाल किया जाना चाहिए. यदि microinjection pipets के बहुमत एक इंजेक्शन सत्र के दौरान भरा हो गया है, कांच pipet खींचने की सेटिंग में फेरबदल करने के लिए एक बड़े खोलने के साथ microinjection pipet सुझावों उत्पादन पर विचार करें.

एक और मुद्दा है कि परमाणु इंजेक्शन के दौरान उठता टिशू कल्चर व्यंजन के नीचे की सतह के असमता है. यह परिवर्तनशीलता सीधे नाभिक को लक्ष्यीकरण इंजेक्शन pipet सुझावों की सटीकता को प्रभावित करता है गहराई के बाद से इंजेक्शन के दौरान pipet traverses तय हो गई है. इसलिए, इस सीमा को z-अक्ष एक ही थाली के भीतर इंजेक्शन के दौरान समायोजित किया जाना चाहिए. यह स्पष्ट हो सकता है जब एक समायोजन आवश्यक है: परमाणु इंजेक्शन के कोई संकेत नहीं है (नाभिक या सेल पूरी तरह से याद किया जाता है में कोई सफेद पंख), या इंजेक्शन pipet टिप पकवान के नीचे करने के लिए करीब आता है (सेल compressing या डिश के तल में भी pipet दुर्घटनाग्रस्त टिप). ग्लास, क्लोनिंग सिलेंडरों (. आयुध डिपो 10 मिमी, बिल्ली सं 2090-01010, Bellco ग्लास, Vineland, NJ) न्यूरॉन्स के चढ़ाना के दौरान इस्तेमाल किया जा सकता है उन्हें एक छोटे, अधिक सीमित क्षेत्र में प्रतिबंधित है, इसलिए स्थानांतरित करने के लिए आवश्यक दूरी को कम इंजेक्शन के बीच इंजेक्शन pipet. ये क्लोनिंग सिलेंडरों microinjections प्रदर्शन करने के लिए पहले हटा रहे हैं.

तकनीक की कमियां:

Intranuclear microinjections तकनीकी की मांग कर रहे हैं, जो धैर्य और ऑपरेटर द्वारा मैनुअल निपुणता की एक उच्च डिग्री की आवश्यकता होती है. इस तकनीक के साथ प्रवीणता, जैसे किसी भी अन्य कौशल के साथ, अभ्यास के साथ आता है. इस प्रकार, यह रिपोर्टर जीन की परमाणु इंजेक्शन वास्तविक प्रयोगों का प्रयास करने से पहले अकेले अभ्यास की सलाह दी है. आगे इंजेक्शन प्रक्रिया में सहायता करने के लिए, यह संभव हो सकता micromanipulator और एक कंप्यूटर प्रोग्राम में सुई लगानेवाला दबाव के इस कदम को मजबूत कर सकते हैं. इगोर प्रो (WaveMetrics, झील Oswego, या) जैसे कार्यक्रम microinjection सेटिंग्स की दुकान और अर्द्ध स्वचालित रूप से इंजेक्शन की प्रक्रिया multifunctional नियंत्रकों (ShuttlePro, समोच्च डिजाइन, Windham, राष्ट्रीय राजमार्ग) कार्यक्रम का उपयोग किया जा सकता है (के लिए 6,7,8 देख विवरण).
Intranuclear microinjection तकनीक का एक और दोष कम सफलता दर है. प्रयास परमाणु इंजेक्शन का लगभग 10-20% प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए सीसा. Whilst यह क्षमता अनुप्रयोगों के लिए पर्याप्त है कि व्यक्त कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या में, उदाहरण के लिए इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, विभिन्न जैव रासायनिक assays के लिए यह पर्याप्त नहीं किया जा सकता है की आवश्यकता नहीं है हो सकता है.

तकनीक के अनुप्रयोग:

अपनी कमियों के बावजूद, डीएनए के intranuclear microinjection heterologously न्यूरॉन्स में प्रोटीन व्यक्त करने के लिए एक अत्यंत उपयोगी तकनीक है.

प्रोटीन अभिव्यक्ति के उच्च स्तर इंजेक्शन, एक अत्यधिक सक्रिय सीएमवी जीन प्रतिलेखन, और नाभिक में plasmids के लंबे स्थिरता विनियमन प्रमोटर के दौरान नाभिक में जारी plasmids के बड़ी संख्या की वजह से परमाणु microinjections के साथ प्राप्त कर रहे हैं. अभिव्यक्ति से अधिक प्रोटीन प्रमुख नकारात्मक प्रयोगों जहां heterologous प्रोटीन का उच्च स्तर के लिए अंतर्जात प्रोटीन डूब के लिए आवश्यक हैं में विशेष रूप से उपयोगी है. Intranuclear इंजेक्शन का एक अन्य लाभ के नाभिक को सीडीएनए constructs का एक सुसंगत अनुपात देने जब एकाधिक constructs इंजेक्ट कर रहे हैं करने की क्षमता है. अन्य अभिकर्मक तरीकों के साथ, यह मुश्किल है reproducibly प्रत्येक डीएनए के एक ही अनुपात परिचय विभिन्न कक्षों में एक ही थाली के भीतर और transfections के बीच का निर्माण. सीडीएनए समाधान के नाभिक में प्रत्यक्ष इंजेक्शन परिवर्तनशीलता के इस स्रोत समाप्त व्यक्त प्रोटीन के अनुपात को प्रभावी ढंग से हो titered की अनुमति देता है है.

अभिकर्मक के पारंपरिक तरीकों की वजह ^से 9 नाभिक और रासायनिक अभिकर्मक reag के साथ जुड़े विषाक्तता में डीएनए की कम समावेश बाद mitotic कोशिकाओं में सीमित प्रभाव है¹⁰ पिता. परमाणु microinjections आनुवंशिक सामग्री नाभिक में यंत्रवत् शुरू करने से इन मुद्दों पर काबू पाने. हालांकि इस तकनीक को और अधिक शामिल है, एक कार्यात्मक जैविक प्रणाली में एक प्रोटीन के प्रभाव का अध्ययन करने की क्षमता, अंतर्जात संकेत दे रास्ते के साथ पूरा, अधिक से अधिक इस तकनीक का श्रमसाध्य प्रकृति के लिए compensates.

राष्ट्रीय संस्थानों के साथ पशु की देखभाल और उपयोग के लिए स्वास्थ्य के दिशा निर्देशों के अनुसार सभी जानवरों पर प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं का प्रदर्शन किया गया.

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Ultrafree-MC Filter Unit		Millipore	UFC30VV00	Durapore PVDF filter; 0.1 μm pore-size
TE buffer		Quality Biological, Inc	351-010-131	10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0
Micro-hematocrit capillary tubes		Fisher Scientific	22-362-574	Unheparinized Preparation: Soak in 100% ethanol overnight. Wash thoroughly with deionized water three times and dry bake glass in an oven (95°C). Cut the cleaned hematocrit tubes into 3-4 cm length pieces using a diamond-tipped scriber, and seal one end closed with a flame and forceps to hold the glass. Store in a clean glass beaker and cover to prevent dust build-up.
Microcentrifuge		Eppendorf	5417 R	With a fixed angle or swinging-bucket rotor
Microloader 20 μl pipet tips		Eppendorf	5242 956.003
Microinjection capillary glass		World Precision Instruments	TW120F-4	Thin-walled with filament, 1.2 mm outer-diameter, 0.9 mm inner-diameter, 100 mm length
Flaming/Brown Micropipette Puller		Sutter Instrument Co.	P-97	With platinum-iridium box filament (part # FB330B)
Nikon Diaphot TMD Inverted Microscope		Nikon		20x and 40x phase-contrast objective lenses, mounted on a vibration isolation table
Charge-coupled device (CCD) camera		Cohu Inc.	6410
Video monitor		Sony Corporation	PVM-122	Black and White, 9” screen
Micromanipulator system		Eppendorf	5171
Microinjection Unit		Eppendorf	FemtoJet Express
Microinjection controller		Contour Design	S-PROV2	Programmable multimedia controller
Igor Pro		WaveMetrics	Version 4.05A	Command program to control the microinjection controller written by S. Ikeda