Este protocolo detalhes a derivação de células-tronco hematopoéticas para transplante de células-tronco embrionárias de rato (ESC) e sua posterior injeção em camundongos letalmente irradiados destinatário. Brevemente, ESC são diferenciados como corpos embrióides, que depois são infectadas com HoxB4 retroviral e co-cultivados com células do estroma OP9 e citocinas hematopoiéticas.
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Artigo de método
Derivação de Células-Tronco Hematopoéticas murino de Células-Tronco Embrionárias
Neste artigo
Resumo
Resumo
Uma célula-tronco é definida como uma célula com capacidade para tanto se auto-renovar e gerar descendência diferenciada múltiplas. Células-tronco embrionárias (ESC) são derivadas do blastocisto do embrião e são pluripotentes na capacidade differentiative. Seu potencial differentiative vasta fez-lhes o foco de muita pesquisa centrada na deduzir como persuadi-los para gerar tipos de células clinicamente útil. A derivação bem-sucedida de células-tronco hematopoiéticas (HSC) de rato ESC foi recentemente realizado e pode ser visualizado neste protocolo de vídeo. HSC, sem dúvida, a população de células clinicamente mais explorados, são usados para tratar uma miríade de malignidades hematopoiéticas e distúrbios. No entanto, muitos pacientes que poderiam se beneficiar da terapia HSC não tem acesso a doadores compatíveis. ESC poderiam fornecer uma fonte alternativa de HSC para estes pacientes. O protocolo a seguir estabelece uma linha de base a partir da qual ESC-HSC podem ser estudados e informar os esforços para isolar HSC da ESC humana. Neste protocolo, ESC são diferenciados como corpos embrióides (EBs) por 6 dias disponíveis comercialmente soro pré-selecionados para a diferenciação ótima hematopoiéticas. EBs são, então, dissociado e infectados com HoxB4 retroviral. Infectados EB células derivadas são semeadas em OP9 estroma, uma linhagem de células de medula óssea estromal derivado da calvária de /-M-CSF - ratos, e co-cultivados na presença de hematopoiese promover citocinas por dez dias. Durante este co-cultura, as células infectadas expandir muito, resultando na geração de uma piscina heterogêneo de 100s de milhões de células. Estas células podem então ser usados para resgatar e reconstituir camundongos letalmente irradiados.
Protocolo
Diferenciação de células-tronco embrionárias
- Coletar um frasco perto confluentes de células-tronco embrionárias (ESC), através de tratamento com tripsina ESC.
- Ressuspender as células em 5 mL de mídia Diferenciação e transferir para um T25 não-revestido de gelatina. Incubar a 37 ° C por 45 minutos. Recuperar o sobrenadante e coletar células através de centrifugação.
Nota: fibroblastos de rato embrionárias (MEFs) das culturas ESC anexar prontamente aos T25 não-revestido de gelatina e, portanto, estão esgotados a partir da cultura durante esta etapa de galvanização. Se você não é o seu cultivo em MEFs ESC, você pode pular a placa pré....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários | |
|---|---|---|---|---|
| Camundongos deficientes em Rag-2/gamma-c C57Bl/6 | Animal | Taconic Farm | ||
| Agitador de placas | Ferramenta | VWR international | 33998-360 | Agitador orbital da Ikaworks |
| Pipetador multicanal | Ferramenta | VWR international | 15000-174 | ePet da BioHit |
| Tripsina ES | Reagente | Invitrogen | 15090-046 | Tripsina 0,25% em PBS |
| Tripsina padrão | Reagente | Invitrogen | 25300-062 | Tripsina-EDTA 0,05% |
| PBS | Tampão | Invitrogen | 20012-027 | |
| Tampão de dissociação livre de enzimas | Tampão | Invitrogen | 13151-014 | |
| Mistura enzimática de dissociação | Tampão | Invitrogen | 17104-019 | 500 mg de Colagenase IV |
| Hialuronidase | Reagente | Sigma-Aldrich | H2126 | congelar em alíquotas de 500 μL e evitar congelamentos e descongelamentos repetidos. |
| DNase | Reagente | Sigma-Aldrich | D4527 | |
| DMEM | Invitrogen | 10-017CV | ||
| Sulfato de protamina | Reagente | Sigma-Aldrich | P3369 | 8 μg/mL |
| Meio de diferenciação EB | meio | Consulte a receita no Protocol.doc anexo | ||
| IMDM 10% | meio | Consulte a receita no Protocol.doc anexo | ||
| IMDM 10% + citocinas | meio | Consulte a receita no Protocol.doc anexo | ||
| anti-MEM 20% | Consulte a receita no Protocol.doc anexo |
Reimpressões e permissões
