병아리 예 비켜 문화와 예 비켜 CAM 어세이 : 그게 정말로 작동하는 방법
Summary
병아리 chorioallantoic 막 (CAM)은 angiogenesis와 tumorigenesis을 연구하는 독특한 자연 immunodeficient 지원 문화 환경입니다. 이 비디오 기사는 여자의 서로 다른 단계를 보여줍니다<em> 예 비켜</em> 문화, 가능성 angiogenic 물질 및 CAM의 표면에 종양 세포와 조직을 성공적으로 접종의 응용 프로그램입니다.
Abstract
번식의 초기 단계에 치킨 계란은 체외에서 생체내 시스템의 사이에 있으며, angiogenesis를 공부뿐만 아니라 tumorigenesis를 공부뿐만 아니라 혈관 테스트 환경을 제공합니다. 여자 chorioallantoic 막 (CAM)가 개발되면, 그 혈관 네트워크는 쉽게 액세스할 수 조작하고 관찰하고 따라서 angiogenesis의 assays에 대한 최적의 설정을 제공합니다. 림프 시스템이 완전히 부화의 늦은 단계까지 개발이 아니므로, 여자의 난자는 종 특정 제한없이 이식할 조직 및 세포를 유지 수있는 자연 immunodeficient 호스트로 제공하고 있습니다. 개발 육성 이외에 allo을하고 xenografts, CAM의 혈관 네트워크는 종양 세포 intravasation, 보급, 그리고 혈관 체포와 체포 세포 마이크로 전이성 foci를 형성 extravasate 저장소를위한 고유 지원 환경을 제공합니다.
실험 목적을 위해, 최근 연구의 대부분의 CAM은 알 껍질을 통해 창문을 절단하고 실험 관찰과 효과의 사진을 문서에 대한 CAM과 가능성의 접근에 상당한 제한의 결과로, 비켜에서 실시되었다하여 노출되었습니다. 전혀 게시된 경우 여자는 배아의 쉘 적은 문화가 1-4 사용했을 때, 어떤 실험 자세한 내용은, 제공하지 않으며 있었다 이러한 문화의 생존 요금이 낮은되었습니다. 우리는 계란 내용의 이성적으로 제어 압출을 도입하여 크게 여자는 배아의 전 비켜 문화의 방법을 정제. 이 전 비켜 문화는 효과의 생체내 문서에 쉽게 활성화 및 배아의 실험 조작을 촉진, CAM 및 여자 태아의 접근을 향상시킵니다. 이것은 과학적인 질문이 다수를 성공적으로 응용 프로그램을 수행할 수 있습니다 (1) 개선 angiogenesis 분석 5,6로, (2) 실험 (3), 여자는 배아 아이 7-9의 유리체에서 촉진 주사에 대한 설정 의 보급과 intravasation위한 테스트 환경 (5 닭고기와 마우스 13은 잘 사지 꽃봉오리의 성공적인 이식과 문화에 대한 개선 유지 시스템으로 CAM 10-12에 주사를 설립 세포 라인에서 종양 세포 (4) 분산으로 )에 대한, 접목 전파 및 CAM 14 표면에 biopsies에서 얻은 탄탄한 기본 종양 조직의 다시 접목.
이 비디오를 문서에서 우리는 세련된 여자는 전 비켜 문화와 50 % 이상 생존 속도 CAM 분석의 설립을 설명합니다. 게다가 우리는 과학 응용 프로그램의 많은에 대한 예 비켜 문화의 성공적인 응용 프로그램의 단계 시범에 의해 단계를 제공합니다.
다니엘 S. 도일, 수잔느 D. 파사, 그리고 세바스찬 Gustmann이 연구에 동등하게 공헌했습니다.
Protocol
모든 장비와 시약은 멸균 구입해야하거나 열 또는 증기 소독 또는 70 % ETOH와 소독을해야합니다. 동물 실험 기관에 의해 규정된 동물 실험 절차와 규정에 대한 동물의 보호 및 사용에 관한 NIH의 지침에 따라, 유럽 커뮤니티 이사회 지침 (86/609/EEC)에 따라 수행다고 저자 상태 관리 및 뒤스부르크 – 에센 대학 (독일)에서위원회 (IACUC)를 사용합니다. 1 부 : 달걀 …
Discussion
혁신 아니면 그냥 다른 아가씨 문화 프로토콜?
전 쉘 적은 문화 프로토콜과 함께 여자는 태아 1-4 전체 생존 요금은, 예를 들어 CA 낮은되었습니다. 30% 1. 이 비디오 문서에 설명되어있는 세련된 전부 비켜 문화 프로토콜은, 대조적으로, 50 % 이상 생존 속도를 허용합니다. 비켜 문화의 고전에 비해 여자는 배아의 전 비켜 문화 크게 CAM과 여자?…
Acknowledgements
저자는 아낌없이 종양 물질을 공급하는 우수한 기술 지원 및 교수 Ruebben에 대한 J. Kueper 및 J. Wittschier 감사하고 싶습니다.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Fertilized Eggs | Animal | Söries Trockels, Germany | ||
| Mice | Animal | Charles Rivers Laboratories | ||
| Incubator Type 3000 with rotating egg tray | Tools | Siepmann GmbH Germany | 9503 | Maintain at 37°C with relative humidity set above 60% |
| Egg incubator BSS 160 | Tools | Grumbach, Germany | 8101 | Maintain at 37-387deg;C with relative humidity set above 60% |
| PBS | Reagent | Sigma | PBS should be cold (> 4°C) and sterile | |
| Dulbecco’s modified eagle’s medium | Reagent | Sigma | D 6429 | DMEM culture medium |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Reagent | Invitrogen | 31415-029 | here: collection medium for tumor samples |
| Tumor cell -specific medium | Reagent | Sigma | each research group should use the medium they culture their tumors cells in or common culture media, e.g. Leibovitz’s Medium or Dulbecco’s modified eagle’s medium supplemented with 15% fetal bovine serum (FBS), 4mM L-glutamine and 50 μM insulin |
|
| 70% EtOH | Reagent | Sigma | ||
| Magnetic stir bar, triangled 80 mm | Tool | VWR | 442-0391 | A triangled magnetic stir bar serves well to crack the eggs shell. |
| Forceps DUMONT #5 | Tool | Fine Science Tools | 11252-30 | bevelled very fine shanks (0.05 mm x 0.02 mm tip) |
| Forceps DUMONT #7 | Tool | Fine Science Tools | 11271-30 | curved shanks (0.07 mm x 0.10 mm tip) |
| Spring scissors, straight, 8cm | Tool | Fine Science Tools | 15000-00 | fine, small straight blades |
| Fine Iris scissors, straight | Tool | Fine Science Tools | 14094-11 | Use to cut our the CAM |
| Standard scissors, straight, sharp/blunt | Tool | Fine Science Tools | 14007-14 | Use for decapitation or cervical dislocation |
| microliter syringe 1702 TLLX, 25 μl | Tool | Hamilton | 80222 | Use for injection into the vitreous |
| Hamilton 33-G needle (15 mm) | Tool | Fine Science Tools | 18073-15 | Use for injection into the vitreous |
| Sterile scalpels | Tool | Use for dissecting tumor samples | ||
| Small drain spoon | Tool | Geuder, Germany | 15758 | Use to transfer of small chick embryos |
| Wax board with fixing pins | Tool | Self made | Use to fix of animals for dissection | |
| Petri dishes 60 x 15 mm | Tool | Greiner | 628102 | |
| Petri dishes 92 x 16 mm | Tool | Sarstedt | 82.1472 | |
| Sterile Petri dish 100 x 20 mm | Tool | Greiner | 664160 | extra deep, with spacers for ventilation |
| Beaker | Tool | 300-600 ml | ||
| FALCON tubes | Tool | FALCON | 15 ml and 50 ml | |
| Eppendorf tubes | Tool | Eppendorf | 1.5 ml and 2 ml | |
| 1ml pipette tips | Tool | Use to cut plastic rings for application of substances / cells | ||
| Peripheral venous catheter (PVL) | Tool | Viggo® | Use to cut silicon rings from the tube for application of substances / cells | |
| Pipettes and tips | Tool | Eppendorf / Abimed | ||
| Autoclaved folded Filters 595 1/2, 110 mm diameter | Tool | Schleicher & Schuell | 311643 | Carrier, which caused least irritation of the CAM; used in the paper |
| PTFE-Pledget, non resorbing, 6,3 x 152.4 x 1.6 mm | Tool | santec-medical | REF 277, LOT 832/511-1 | Carrier; caused false positive results |
| Hxdroxyethylcellulose Tylose H 100000 | Reagent | Carrier mixed with Kollidon 17 PF; caused false positive results | ||
| Kollidon 17 PF | Reagent | BASF | S30200 | mixed with Hydroxyethylcellulose; caused false positive results |
| Collagen Biomatrix TissuDura | Tool | Baxter Healthcare S.A. | REF B2246000999999 | Carrier; caused false positive results |
| Round glass cover slips, 11 mm | Tool | Assistent Germany | 1001/0011 | Carrier; causes false positive results |
| Bovine Collagen Sponge | Tool | Wyeth | Carrier; caused false positive results | |
| Resodont Absorbable Collagen Membrane | Tool | Resorba Woundcare Germany | LOT 280303 | Carrier; caused false positive results |
| Non-Woven Swabs | Tool | Fink & Walter GmbH | REF 328132 | Carrier; caused false positive results |
Referências
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Citar este artigo
Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Dünker, N. Chick ex ovo Culture and ex ovo CAM Assay: How it Really Works. J. Vis. Exp. (33), e1620, doi:10.3791/1620 (2009).