كتكوت البيضة السابقين الثقافة و البيضة السابقين CAM الفحص : كيف يعمل حقا
Summary
وفرخ مشيمائي غشاء (CAM) هي فريدة من نوعها ، العوز المناعي طبيعيا بيئة ثقافة داعمة لدراسة الأوعية الدموية وتكون الأورام. هذه المقالة الفيديو يوضح الخطوات المختلفة في الفرخ<em> البيضة السابقين</em> الثقافة ، وتطبيق مواد يحتمل أن تكون وعائية التلقيح الناجح للخلايا وأنسجة الورم على سطح CAM.
Abstract
بيض الدجاج في مرحلة مبكرة ما بين تربية في المختبر والمجراة في النظم وتوفير بيئة اختبار الأوعية الدموية ، ليس فقط لدراسة الأوعية الدموية ولكن أيضا لدراسة تكون الأورام. بعد غشاء مشيمائي الفرخ (CAM) وقد وضعت ، ويمكن شبكتها الاوعية الدموية يمكن الوصول إليها بسهولة ، والتلاعب بها ومراعاتها ، وبالتالي يوفر بيئة مثالية لفحوصات الأوعية الدموية. لأن النظام لا اللمفاوية تطويره بالكامل حتى مراحل متأخرة من الحضانة ، الجنين الفرخ بمثابة المضيف العوز المناعي بشكل طبيعي قادر على الحفاظ على الأنسجة والخلايا المطعمة أنواع محددة من دون قيود. بالإضافة إلى رعاية وتطوير ألو xenografts ، والأوعية الدموية CAM الشبكة يوفر بيئة داعمة لفريد intravasation الخلية السرطانية ، والنشر ، واعتقال الأوعية الدموية والخلايا مستودع حيث اعتقل يتسرب إلى النموذج الصغير المتنقل البؤر.
لأغراض تجريبية ، في معظم الدراسات التي تعرضت لها مؤخرا بقطع CAM نافذة من خلال قشرة البيضة وأجريت التجارب في البيضة ، مما أدى إلى فرض قيود كبيرة في الوصول للCAM وإمكانيات المراقبة وثائق صورة من الآثار. كانت معدلات البقاء على قيد الحياة من هذه الثقافات وعندما استخدمت قذيفة أقل ثقافات الجنين الفرخ 1-4 ، تقدم أية تفاصيل التجريبية ، وإذا نشرت على الإطلاق ، منخفضة. نحن المكرر طريقة البيضة الثقافة السابقين لافراخ الدجاج بشكل ملحوظ من خلال طرح عقلاني من قذف للرقابة على محتوى البيضة. هذه الثقافات السابقين البيضة تعزيز إمكانية الوصول إلى الجنين CAM وفرخ ، مما سهل في الوثائق المجراة من الآثار وتسهيل التلاعب التجريبية للجنين. يسمح هذا التطبيق الناجح لعدد كبير من المسائل العلمية : (1) باعتبارها مقايسة تحسين الأوعية الدموية 5،6 ، (2) والتجريبية التي أنشئت من أجل تسهيل الحقن في الجسم الزجاجي للعين الفرخ الجنين 7-9 ، (3) كما فرقت بيئة اختبار للنشر وintravasation الخلايا السرطانية من خطوط الخلايا أنشئت على تلقيح CAM 10-12 ، (4) وتحسين نظام دعم لعملية زرع ناجحة وثقافة براعم الأطراف من الدجاج والفئران وكذلك 13 (5 ) للترقيع ، ونشر ، وإعادة ترقيع الصلبة نسيج الورم الرئيسي الحصول عليها من الخزعات على سطح CAM 14.
في هذه المقالة الفيديو وصفنا في إرساء ثقافة الفرخ السابقين المكرر البيضة وCAM مقايسة مع معدلات البقاء على قيد الحياة أكثر من 50 ٪. إلى جانب نقدم خطوة خطوة من خلال مظاهرة للتطبيق الناجح للثقافة البيضة السابقين لعدد كبير من التطبيقات العلمية.
ساهم دانيال س بحسب دوليه ، سوزان دال باشا ، وسيباستيان Gustmann بالتساوي على هذه الدراسة.
Protocol
Discussion
مبتكرة أو مجرد ثقافة الفرخ بروتوكول آخر؟
مع بروتوكولات الثقافة السابق قذيفة كانت أقل من معدلات البقاء على قيد الحياة 1-4 الإجمالية للأجنة الدجاج منخفضة ، مثل كاليفورنيا. 30 ٪ 1. والمكرر بروتوكول السابقين الثقافة …
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر J. J. Kueper وWittschier للحصول على مساعدة فنية ممتازة وRuebben البروفيسور لتوريد المواد بسخاء الورم.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Fertilized Eggs | Animal | Söries Trockels, Germany | ||
| Mice | Animal | Charles Rivers Laboratories | ||
| Incubator Type 3000 with rotating egg tray | Tools | Siepmann GmbH Germany | 9503 | Maintain at 37°C with relative humidity set above 60% |
| Egg incubator BSS 160 | Tools | Grumbach, Germany | 8101 | Maintain at 37-387deg;C with relative humidity set above 60% |
| PBS | Reagent | Sigma | PBS should be cold (> 4°C) and sterile | |
| Dulbecco’s modified eagle’s medium | Reagent | Sigma | D 6429 | DMEM culture medium |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Reagent | Invitrogen | 31415-029 | here: collection medium for tumor samples |
| Tumor cell -specific medium | Reagent | Sigma | each research group should use the medium they culture their tumors cells in or common culture media, e.g. Leibovitz’s Medium or Dulbecco’s modified eagle’s medium supplemented with 15% fetal bovine serum (FBS), 4mM L-glutamine and 50 μM insulin |
|
| 70% EtOH | Reagent | Sigma | ||
| Magnetic stir bar, triangled 80 mm | Tool | VWR | 442-0391 | A triangled magnetic stir bar serves well to crack the eggs shell. |
| Forceps DUMONT #5 | Tool | Fine Science Tools | 11252-30 | bevelled very fine shanks (0.05 mm x 0.02 mm tip) |
| Forceps DUMONT #7 | Tool | Fine Science Tools | 11271-30 | curved shanks (0.07 mm x 0.10 mm tip) |
| Spring scissors, straight, 8cm | Tool | Fine Science Tools | 15000-00 | fine, small straight blades |
| Fine Iris scissors, straight | Tool | Fine Science Tools | 14094-11 | Use to cut our the CAM |
| Standard scissors, straight, sharp/blunt | Tool | Fine Science Tools | 14007-14 | Use for decapitation or cervical dislocation |
| microliter syringe 1702 TLLX, 25 μl | Tool | Hamilton | 80222 | Use for injection into the vitreous |
| Hamilton 33-G needle (15 mm) | Tool | Fine Science Tools | 18073-15 | Use for injection into the vitreous |
| Sterile scalpels | Tool | Use for dissecting tumor samples | ||
| Small drain spoon | Tool | Geuder, Germany | 15758 | Use to transfer of small chick embryos |
| Wax board with fixing pins | Tool | Self made | Use to fix of animals for dissection | |
| Petri dishes 60 x 15 mm | Tool | Greiner | 628102 | |
| Petri dishes 92 x 16 mm | Tool | Sarstedt | 82.1472 | |
| Sterile Petri dish 100 x 20 mm | Tool | Greiner | 664160 | extra deep, with spacers for ventilation |
| Beaker | Tool | 300-600 ml | ||
| FALCON tubes | Tool | FALCON | 15 ml and 50 ml | |
| Eppendorf tubes | Tool | Eppendorf | 1.5 ml and 2 ml | |
| 1ml pipette tips | Tool | Use to cut plastic rings for application of substances / cells | ||
| Peripheral venous catheter (PVL) | Tool | Viggo® | Use to cut silicon rings from the tube for application of substances / cells | |
| Pipettes and tips | Tool | Eppendorf / Abimed | ||
| Autoclaved folded Filters 595 1/2, 110 mm diameter | Tool | Schleicher & Schuell | 311643 | Carrier, which caused least irritation of the CAM; used in the paper |
| PTFE-Pledget, non resorbing, 6,3 x 152.4 x 1.6 mm | Tool | santec-medical | REF 277, LOT 832/511-1 | Carrier; caused false positive results |
| Hxdroxyethylcellulose Tylose H 100000 | Reagent | Carrier mixed with Kollidon 17 PF; caused false positive results | ||
| Kollidon 17 PF | Reagent | BASF | S30200 | mixed with Hydroxyethylcellulose; caused false positive results |
| Collagen Biomatrix TissuDura | Tool | Baxter Healthcare S.A. | REF B2246000999999 | Carrier; caused false positive results |
| Round glass cover slips, 11 mm | Tool | Assistent Germany | 1001/0011 | Carrier; causes false positive results |
| Bovine Collagen Sponge | Tool | Wyeth | Carrier; caused false positive results | |
| Resodont Absorbable Collagen Membrane | Tool | Resorba Woundcare Germany | LOT 280303 | Carrier; caused false positive results |
| Non-Woven Swabs | Tool | Fink & Walter GmbH | REF 328132 | Carrier; caused false positive results |
Referências
- Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. A simple procedure for long-term cultivation of chicken embryos. Dev. Biol. 41, 391-394 (1974).
- Tufan, A. C., Akdogan, I., Adiguzel, E. Shell-less culture of the chick embryo as a model system in the study of development neurobiology. Neuroanatomy. 3, 8-11 (2004).
- Deryugina, E. I., Quigley, J. P. Chick embryo chorioallantoic membrane models to quantify angiogenesis induced by inflammatory and tumor cells or purified effector molecules. Methods Enzymology. 444, 21-44 (2008).
- Ribatti, D. Chick embryo chorioallantoic membrane as a useful tool to study angiogenesis. Int. Rev. Cell Mol. Biol. 270, 181-224 (2008).
- Höckel, M., Sasse, J., Wissler, J. H. Purified monocyte-derived angiogenic substance (angiotropin) stimulates migration, phenotypic changes, and “tube formation” but not proliferation of capillary endothelial cells in vitro. J. Cell Physiol. 133, 1-13 (1987).
- Wissler, J. H. Engineering of blood vessel patterns by Angio Morphogens [Angiotropins]. Materialwiss. Werkstofftech. 32, 984-1008 (2001).
- Kistler, H. B. . J. r. .., LaVail, J. H. Penetration of horseradish peroxidase into the optic nerve after vitreal or vascular injections in the developing chick. Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 20, 705-716 (1981).
- Halfter, W. Change in embryonic eye size and retinal cell proliferation following intravitreal injection of glycosaminoglycans. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 49, 3289-3298 (2008).
- Oppitz, M., Busch, C., Shriek, G., Metzger, M., Just, L., Drews, U. Non-malignant migration of B16 mouse melanoma cells in the neural crest and invasive growth in the eye cup of the chick embryo. Melanoma Res. 17, 17-30 (2007).
- Uchibayashi, T., Egawa, M., Nakajima, K., Hisazumi, H., Tanaka, M., Endo, Y., Sasaki, T. Responses of tumour cell lines implanted onto the chorioallantoic membrane of chick embryo to anticancer agents in combination with hyperthermia. Urol. Res. 20, 237-239 (1992).
- Demir, R., Naschberger, L., Demir, I., Melling, N., Dimmler, A., Papadopoulus, T., Sturzl, M., Klein, P., Hohenberger, W. Hypoxia generates a more invasive phenotype of tumour cells: an in vivo experimental setup based on the chorioallantoic membrane. Pathol. Oncol. Res. , (2008).
- Kunzi-Rapp, K., Genze, F., Kufer, R., Reich, E., Hautmann, R. E., Gschwend, J. E. Chorioallantoic membrane assay: vascularized 3-dimensional cell culture system for human prostate cancer cells as an animal substitute model. J. Urol. 166, 1502-1507 (2001).
- Hall, B. K. Grafting of organs and tissues to the chorioallantoic membrane of the embryonic chick. TCA Manual. 4 (3), 881-883 (1978).
- Kunzi-Rapp, K., Kaskel, P., Steiner, R., Peter, R. U., Krahn, G. Increased blood levels of human S100 in melanoma chick embryo xenografts’ circulation. Pigment Cell Res. 14, 9-13 (2001).
- McFall, R. C., Sery, T. W., Makadon, M. Characterization of a new continuous cell line derived from a human retinoblastoma. Pesquisa do Câncer. 37, 1003-1010 (1977).
- Deryugina, E. I., Zijlstra, A., Partridge, J. J., Kupriyanova, T. A., Madsen, M. A., Papagiannakopoulos, T., Quigley, J. P. Unexpected effect of matrix metalloproteinase down-regulation on vascular intravasation and metastasis of human fibrosarcoma cells selected in vivo for high rates of dissemination. Pesquisa do Câncer. 65, 10959-10969 (2005).
- Kim, J., Kovalski, K., Ossowski, L. requirement for specific proteases in cancer cell intravasation as revealed by a novel semiquantitative PCR-based assay. Cell. 94, 353-362 (1998).
