Poussin<em> Ovo ex</em> Culture et<em> Ovo ex</em> CAM Test: Comment il fonctionne vraiment

Summary

La membrane chorio-allantoïde de poulet (CAM) est un environnement unique et naturellement immunodéficients culture favorable pour étudier l'angiogenèse et de la tumorigenèse. Cet article vidéo montre les différentes étapes de poussin<em> Ovo ex</em> Culture, à l'application de substances potentiellement angiogéniques et l'inoculation des cellules tumorales avec succès et les tissus sur la surface de la came.

Abstract

Les œufs de poule dans la première phase de reproduction sont entre données in vitro et de vivo et de fournir un environnement de test vasculaire non seulement d'étudier l'angiogenèse mais aussi d'étudier la tumorigenèse. Après que la membrane chorio-allantoïde de poulet (CAM) a mis au point, son réseau de vaisseaux sanguins peut être facilement accessible, manipulé et observé et permet donc un réglage optimal pour les essais d'angiogenèse. Comme le système lymphoïde n'est pas complètement développée jusqu'aux stades tardifs de l'incubation, l'embryon de poulet sert d'hôte immunodéprimé naturellement capable de soutenir les tissus et les cellules greffées sans restrictions spécifiques à l'espèce. En plus de nourrir le développement d'allo-et xénogreffes, le réseau de vaisseaux sanguins CAM offre un contexte favorable à la intravasation cellules tumorales, la diffusion et l'arrestation vasculaire et un référentiel dans lequel les cellules arrêtées s'extravaser pour former des micro foyers métastatiques.

À des fins expérimentales, en moer des études récentes, le CAM a été exposée en coupant une fenêtre à travers la coquille d'oeuf et expériences ont été réalisées in ovo, ce qui entraîne des limitations significatives dans l'accessibilité de la CAM et possibilités pour l'observation et la documentation photographique des effets. Quand le shell-moins des cultures de l'embryon de poulet ont été utilisés ^1-4, pas de détails expérimentaux ont été fournis et, si publiées, les taux de survie de ces cultures étaient faibles. Nous avons affiné la méthode de culture in ovo ex d'embryons de poulet de façon significative par l'introduction d'une extrusion contrôlée rationnelle de la teneur en œuf. Ces cultures ex ovo améliorer l'accessibilité de l'embryon CAM et Chick, ce qui permet facilement dans la documentation in vivo des effets et de faciliter la manipulation expérimentale de l'embryon. Cela permet à l'application réussie d'un grand nombre de questions scientifiques: (1) Comme un essai d'angiogenèse amélioration de ^5,6, (2) un dispositif expérimental mis en place pour les injections de faciliter l'établissement ee vitré de l'oeil d'embryon de poulet ^7-9, (3) comme un environnement de test pour la diffusion et la dispersion de intravasation cellules tumorales à partir de lignées cellulaires établies inoculées sur la CAM, ^10-12 (4) en tant que système de maintien amélioré pour la transplantation réussie et culture de bourgeons de membres de poulet et ¹³ souris ainsi que (5) pour le greffage, de propagation, et de nouveau la greffe de tissu tumoral solide primaire obtenu à partir de biopsies de la surface de la came ^14.

Dans cet article, nous décrivons la vidéo mise en place d'une culture raffinée poussin ex ovo et le dosage CAM avec des taux de survie de plus de 50%. En plus nous offrons une démonstration étape par étape de l'application réussie de la culture ex ovo pour un grand nombre d'applications scientifiques.

Daniel S. Dohle, Susanne D. Pasa, et Sebastian Gustmann contribué également à cette étude.

Protocol

Tout le matériel et les réactifs doivent être achetés stérile ou doit être stérilisé à la vapeur ou de la chaleur ou stérilisé avec de l'EtOH 70%. Les auteurs indiquent que les expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les Communautés européennes Directive du Conseil (86/609/CEE), en suivant les directives du NIH concernant le soin et l'utilisation des animaux à des procédures expérimentales et les règlements établis par l'Animal ins…

Discussion

Novateur ou juste un autre protocole de culture poussin?

Avec les anciens protocoles de culture sans coquille ^1-4 le taux de survie total des embryons de poulet ont été faibles, par exemple ca. 30% ^1. Le protocole ex ovo culture raffinée décrit dans cet article la vidéo, en revanche, permet des taux de survie de plus de 50%. Par rapport à la musique classique dans des cultures in ovo culture ex ovo d'embryons de poulet facil…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Fertilized Eggs	Animal	Söries Trockels, Germany
Mice	Animal	Charles Rivers Laboratories
Incubator Type 3000 with rotating egg tray	Tools	Siepmann GmbH Germany	9503	Maintain at 37°C with relative humidity set above 60%
Egg incubator BSS 160	Tools	Grumbach, Germany	8101	Maintain at 37-387deg;C with relative humidity set above 60%
PBS	Reagent	Sigma		PBS should be cold (> 4°C) and sterile
Dulbecco’s modified eagle’s medium	Reagent	Sigma	D 6429	DMEM culture medium
Leibovitz’s L-15 Medium	Reagent	Invitrogen	31415-029	here: collection medium for tumor samples
Tumor cell -specific medium	Reagent	Sigma		each research group should use the medium they culture their tumors cells in or common culture media, e.g. Leibovitz’s Medium or Dulbecco’s modified eagle’s medium supplemented with 15% fetal bovine serum (FBS), 4mM L-glutamine and 50 μM insulin
70% EtOH	Reagent	Sigma
Magnetic stir bar, triangled 80 mm	Tool	VWR	442-0391	A triangled magnetic stir bar serves well to crack the eggs shell.
Forceps DUMONT #5	Tool	Fine Science Tools	11252-30	bevelled very fine shanks (0.05 mm x 0.02 mm tip)
Forceps DUMONT #7	Tool	Fine Science Tools	11271-30	curved shanks (0.07 mm x 0.10 mm tip)
Spring scissors, straight, 8cm	Tool	Fine Science Tools	15000-00	fine, small straight blades
Fine Iris scissors, straight	Tool	Fine Science Tools	14094-11	Use to cut our the CAM
Standard scissors, straight, sharp/blunt	Tool	Fine Science Tools	14007-14	Use for decapitation or cervical dislocation
microliter syringe 1702 TLLX, 25 μl	Tool	Hamilton	80222	Use for injection into the vitreous
Hamilton 33-G needle (15 mm)	Tool	Fine Science Tools	18073-15	Use for injection into the vitreous
Sterile scalpels	Tool			Use for dissecting tumor samples
Small drain spoon	Tool	Geuder, Germany	15758	Use to transfer of small chick embryos
Wax board with fixing pins	Tool	Self made		Use to fix of animals for dissection
Petri dishes 60 x 15 mm	Tool	Greiner	628102
Petri dishes 92 x 16 mm	Tool	Sarstedt	82.1472
Sterile Petri dish 100 x 20 mm	Tool	Greiner	664160	extra deep, with spacers for ventilation
Beaker	Tool			300-600 ml
FALCON tubes	Tool	FALCON		15 ml and 50 ml
Eppendorf tubes	Tool	Eppendorf		1.5 ml and 2 ml
1ml pipette tips	Tool			Use to cut plastic rings for application of substances / cells
Peripheral venous catheter (PVL)	Tool	Viggo®		Use to cut silicon rings from the tube for application of substances / cells
Pipettes and tips	Tool	Eppendorf / Abimed
Autoclaved folded Filters 595 1/2, 110 mm diameter	Tool	Schleicher & Schuell	311643	Carrier, which caused least irritation of the CAM; used in the paper
PTFE-Pledget, non resorbing, 6,3 x 152.4 x 1.6 mm	Tool	santec-medical	REF 277, LOT 832/511-1	Carrier; caused false positive results
Hxdroxyethylcellulose Tylose H 100000	Reagent			Carrier mixed with Kollidon 17 PF; caused false positive results
Kollidon 17 PF	Reagent	BASF	S30200	mixed with Hydroxyethylcellulose; caused false positive results
Collagen Biomatrix TissuDura	Tool	Baxter Healthcare S.A.	REF B2246000999999	Carrier; caused false positive results
Round glass cover slips, 11 mm	Tool	Assistent Germany	1001/0011	Carrier; causes false positive results
Bovine Collagen Sponge	Tool	Wyeth		Carrier; caused false positive results
Resodont Absorbable Collagen Membrane	Tool	Resorba Woundcare Germany	LOT 280303	Carrier; caused false positive results
Non-Woven Swabs	Tool	Fink & Walter GmbH	REF 328132	Carrier; caused false positive results