אפרוח אובו לשעבר תרבות אובו לשעבר CAM Assay: איך זה באמת עובד
Summary
Chorioallantoic חומוס קרום (רמ"א) הוא ייחודי, immunodeficient באופן טבעי בסביבה תומכת תרבות ללמוד אנגיוגנזה tumorigenesis. מאמר זה וידאו מדגים את השלבים השונים חומוס<em> אובו לשעבר</emתרבות>, היישום של חומרים angiogenic פוטנציאל חיסון מוצלח של תאים ורקמות הגידול על פני השטח של CAM.
Abstract
ביצים עוף בשלב מוקדם של הגידול הם בין במבחנה מערכות vivo ולספק סביבת מבחן כלי הדם לא רק ללמוד אנגיוגנזה אלא גם ללמוד tumorigenesis. לאחר קרום chorioallantoic חומוס (רמ"א) פיתחה, כלי הדם שלה ברשת ניתן לגשת בקלות, מניפולציות נצפתה ולכן מספק הגדרה אופטימלית עבור מבחני אנגיוגנזה. מאז מערכת הלימפה אינה מפותחת עד בשלבים המאוחרים של דגירה, הגוזל את העובר משמש כמארח immunodeficient טבעי המסוגל לקיים רקמות ותאים מורכבים ללא מינים ספציפיים הגבלות. בנוסף לטיפוח פיתוח Allo ו xenografts, רשת כלי הדם CAM מספק סביבה תומכת באופן ייחודי עבור intravasation תא הפצת גידול, ולעצור את כלי הדם ומאגר שבו תאים נעצר extravasate כדי ליצור מיקרו גרורתי מוקדים.
לצורך הניסוי, ברוב המחקרים האחרונים CAM נחשף על ידי חיתוך חלון דרך הקליפה ביצה הניסויים בוצעו אובו, וכתוצאה מכך מגבלות משמעותיות בנגישות של CAM ואת אפשרויות התצפית ותיעוד תמונה של אפקטים. כאשר פגז פחות תרבויות של העובר גוזל שימשו 1-4, לא נמסרו פרטים ניסיוני, ואם פירסם בכלל, שיעורי ההישרדות של תרבויות אלה היו נמוכים. מיקדנו את השיטה של התרבות אובו לשעבר של עוברים חומוס באופן משמעותי על ידי החדרת שחול נשלט באופן רציונלי של תוכן הביצה. אלו תרבויות אובו לשעבר לשפר את הנגישות של העובר CAM ו האפרוח, המאפשר קל בתיעוד vivo של תופעות והקלה מניפולציה ניסויית של העובר. זה מאפשר יישום מוצלח למספר רב של שאלות מדעיות: (1) החל assay אנגיוגנזה משופרת 5,6, (2) ניסיוני להגדיר עבור זריקות בהנחייתם של הזגוגית של העין חומוס העובר 7-9, (3) כמו סביבת מבחן להפצת ו intravasation של פיזור תאים סרטניים של שורות תאים הוקמה מחוסן על CAM 10-12, (4) כמערכת בשמירה משופרת עבור השתלה מוצלחת של תרבות ניצנים איבר של עוף ועכברים 13 וכן (5 ) עבור השתלת, התפשטות, מחדש השתלת רקמת מוצק הגידול הראשוני המתקבל ביופסיות על פני השטח של CAM 14.
במאמר זה אנו מתארים וידאו הקמתה של תרבות לשעבר מעודן חומוס אובו ו assay CAM עם שיעורי ההישרדות מעל 50%. מלבד זאת אנו מספקים צעד אחר צעד הפגנה של יישום מוצלח של התרבות אובו לשעבר למספר רב של יישומים מדעיים.
דניאל ס Dohle, סוזן ד Pasa, וסבסטיאן Gustmann תרמו באופן שווה על מחקר זה.
Protocol
Discussion
חדשני או רק עוד פרוטוקול תרבות חומוס?
עם הקליפה פחות פרוטוקולים לשעבר תרבות 1-4 שיעורי ההישרדות הכולל של עוברי אפרוח היו נמוכים, כגון CA. 30% 1. לשעבר מעודן אובו תרבות פרוטוקול המתואר במאמר זה וידאו, לעומת זאת, מאפ…
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות Kueper ג'וג' Wittschier לקבלת סיוע טכני מעולה פרופ Ruebben עבור בנדיבות באספקת חומר גידול.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Fertilized Eggs | Animal | Söries Trockels, Germany | ||
| Mice | Animal | Charles Rivers Laboratories | ||
| Incubator Type 3000 with rotating egg tray | Tools | Siepmann GmbH Germany | 9503 | Maintain at 37°C with relative humidity set above 60% |
| Egg incubator BSS 160 | Tools | Grumbach, Germany | 8101 | Maintain at 37-387deg;C with relative humidity set above 60% |
| PBS | Reagent | Sigma | PBS should be cold (> 4°C) and sterile | |
| Dulbecco’s modified eagle’s medium | Reagent | Sigma | D 6429 | DMEM culture medium |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Reagent | Invitrogen | 31415-029 | here: collection medium for tumor samples |
| Tumor cell -specific medium | Reagent | Sigma | each research group should use the medium they culture their tumors cells in or common culture media, e.g. Leibovitz’s Medium or Dulbecco’s modified eagle’s medium supplemented with 15% fetal bovine serum (FBS), 4mM L-glutamine and 50 μM insulin |
|
| 70% EtOH | Reagent | Sigma | ||
| Magnetic stir bar, triangled 80 mm | Tool | VWR | 442-0391 | A triangled magnetic stir bar serves well to crack the eggs shell. |
| Forceps DUMONT #5 | Tool | Fine Science Tools | 11252-30 | bevelled very fine shanks (0.05 mm x 0.02 mm tip) |
| Forceps DUMONT #7 | Tool | Fine Science Tools | 11271-30 | curved shanks (0.07 mm x 0.10 mm tip) |
| Spring scissors, straight, 8cm | Tool | Fine Science Tools | 15000-00 | fine, small straight blades |
| Fine Iris scissors, straight | Tool | Fine Science Tools | 14094-11 | Use to cut our the CAM |
| Standard scissors, straight, sharp/blunt | Tool | Fine Science Tools | 14007-14 | Use for decapitation or cervical dislocation |
| microliter syringe 1702 TLLX, 25 μl | Tool | Hamilton | 80222 | Use for injection into the vitreous |
| Hamilton 33-G needle (15 mm) | Tool | Fine Science Tools | 18073-15 | Use for injection into the vitreous |
| Sterile scalpels | Tool | Use for dissecting tumor samples | ||
| Small drain spoon | Tool | Geuder, Germany | 15758 | Use to transfer of small chick embryos |
| Wax board with fixing pins | Tool | Self made | Use to fix of animals for dissection | |
| Petri dishes 60 x 15 mm | Tool | Greiner | 628102 | |
| Petri dishes 92 x 16 mm | Tool | Sarstedt | 82.1472 | |
| Sterile Petri dish 100 x 20 mm | Tool | Greiner | 664160 | extra deep, with spacers for ventilation |
| Beaker | Tool | 300-600 ml | ||
| FALCON tubes | Tool | FALCON | 15 ml and 50 ml | |
| Eppendorf tubes | Tool | Eppendorf | 1.5 ml and 2 ml | |
| 1ml pipette tips | Tool | Use to cut plastic rings for application of substances / cells | ||
| Peripheral venous catheter (PVL) | Tool | Viggo® | Use to cut silicon rings from the tube for application of substances / cells | |
| Pipettes and tips | Tool | Eppendorf / Abimed | ||
| Autoclaved folded Filters 595 1/2, 110 mm diameter | Tool | Schleicher & Schuell | 311643 | Carrier, which caused least irritation of the CAM; used in the paper |
| PTFE-Pledget, non resorbing, 6,3 x 152.4 x 1.6 mm | Tool | santec-medical | REF 277, LOT 832/511-1 | Carrier; caused false positive results |
| Hxdroxyethylcellulose Tylose H 100000 | Reagent | Carrier mixed with Kollidon 17 PF; caused false positive results | ||
| Kollidon 17 PF | Reagent | BASF | S30200 | mixed with Hydroxyethylcellulose; caused false positive results |
| Collagen Biomatrix TissuDura | Tool | Baxter Healthcare S.A. | REF B2246000999999 | Carrier; caused false positive results |
| Round glass cover slips, 11 mm | Tool | Assistent Germany | 1001/0011 | Carrier; causes false positive results |
| Bovine Collagen Sponge | Tool | Wyeth | Carrier; caused false positive results | |
| Resodont Absorbable Collagen Membrane | Tool | Resorba Woundcare Germany | LOT 280303 | Carrier; caused false positive results |
| Non-Woven Swabs | Tool | Fink & Walter GmbH | REF 328132 | Carrier; caused false positive results |
Referências
- Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. A simple procedure for long-term cultivation of chicken embryos. Dev. Biol. 41, 391-394 (1974).
- Tufan, A. C., Akdogan, I., Adiguzel, E. Shell-less culture of the chick embryo as a model system in the study of development neurobiology. Neuroanatomy. 3, 8-11 (2004).
- Deryugina, E. I., Quigley, J. P. Chick embryo chorioallantoic membrane models to quantify angiogenesis induced by inflammatory and tumor cells or purified effector molecules. Methods Enzymology. 444, 21-44 (2008).
- Ribatti, D. Chick embryo chorioallantoic membrane as a useful tool to study angiogenesis. Int. Rev. Cell Mol. Biol. 270, 181-224 (2008).
- Höckel, M., Sasse, J., Wissler, J. H. Purified monocyte-derived angiogenic substance (angiotropin) stimulates migration, phenotypic changes, and “tube formation” but not proliferation of capillary endothelial cells in vitro. J. Cell Physiol. 133, 1-13 (1987).
- Wissler, J. H. Engineering of blood vessel patterns by Angio Morphogens [Angiotropins]. Materialwiss. Werkstofftech. 32, 984-1008 (2001).
- Kistler, H. B. . J. r. .., LaVail, J. H. Penetration of horseradish peroxidase into the optic nerve after vitreal or vascular injections in the developing chick. Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 20, 705-716 (1981).
- Halfter, W. Change in embryonic eye size and retinal cell proliferation following intravitreal injection of glycosaminoglycans. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 49, 3289-3298 (2008).
- Oppitz, M., Busch, C., Shriek, G., Metzger, M., Just, L., Drews, U. Non-malignant migration of B16 mouse melanoma cells in the neural crest and invasive growth in the eye cup of the chick embryo. Melanoma Res. 17, 17-30 (2007).
- Uchibayashi, T., Egawa, M., Nakajima, K., Hisazumi, H., Tanaka, M., Endo, Y., Sasaki, T. Responses of tumour cell lines implanted onto the chorioallantoic membrane of chick embryo to anticancer agents in combination with hyperthermia. Urol. Res. 20, 237-239 (1992).
- Demir, R., Naschberger, L., Demir, I., Melling, N., Dimmler, A., Papadopoulus, T., Sturzl, M., Klein, P., Hohenberger, W. Hypoxia generates a more invasive phenotype of tumour cells: an in vivo experimental setup based on the chorioallantoic membrane. Pathol. Oncol. Res. , (2008).
- Kunzi-Rapp, K., Genze, F., Kufer, R., Reich, E., Hautmann, R. E., Gschwend, J. E. Chorioallantoic membrane assay: vascularized 3-dimensional cell culture system for human prostate cancer cells as an animal substitute model. J. Urol. 166, 1502-1507 (2001).
- Hall, B. K. Grafting of organs and tissues to the chorioallantoic membrane of the embryonic chick. TCA Manual. 4 (3), 881-883 (1978).
- Kunzi-Rapp, K., Kaskel, P., Steiner, R., Peter, R. U., Krahn, G. Increased blood levels of human S100 in melanoma chick embryo xenografts’ circulation. Pigment Cell Res. 14, 9-13 (2001).
- McFall, R. C., Sery, T. W., Makadon, M. Characterization of a new continuous cell line derived from a human retinoblastoma. Pesquisa do Câncer. 37, 1003-1010 (1977).
- Deryugina, E. I., Zijlstra, A., Partridge, J. J., Kupriyanova, T. A., Madsen, M. A., Papagiannakopoulos, T., Quigley, J. P. Unexpected effect of matrix metalloproteinase down-regulation on vascular intravasation and metastasis of human fibrosarcoma cells selected in vivo for high rates of dissemination. Pesquisa do Câncer. 65, 10959-10969 (2005).
- Kim, J., Kovalski, K., Ossowski, L. requirement for specific proteases in cancer cell intravasation as revealed by a novel semiquantitative PCR-based assay. Cell. 94, 353-362 (1998).
