Pulcino Ex ovo Cultura e Ex ovo CAM saggio: Come funziona veramente
Summary
Il pulcino corioallantoidea membrana (CAM) è un ambiente unico e naturalmente immunodeficienti cultura di sostegno allo studio dell'angiogenesi e tumorigenesi. In questo articolo video mostra le varie fasi pulcino<em> Ex ovo</emCultura>, l'applicazione di sostanze potenzialmente angiogenici e inoculazione di successo delle cellule tumorali e tessuti sulla superficie del CAM.
Abstract
Uova di gallina nella prima fase di allevamento sono tra dati in vitro e in vivo e sistemi di fornire un ambiente di test vascolare non solo per studiare l'angiogenesi, ma anche per studiare tumorigenesi. Dopo la membrana pulcino corioallantoidea (CAM) ha sviluppato, la sua rete di vasi sanguigni possono essere facilmente accessibili, manipolato e osservato e quindi fornisce un ambiente ottimale per le analisi angiogenesi. Dato che il sistema linfatico non è completamente sviluppato fino ultime fasi di incubazione, l'embrione di pollo serve come ospiti naturali immunodeficienti in grado di sostenere i tessuti e le cellule senza innestato specie-specifiche restrizioni. Oltre a coltivare lo sviluppo di allo-e xenotrapianti, la rete di vasi sanguigni CAM offre un ambiente unico e di sostegno per intravasation delle cellule tumorali, la diffusione e l'arresto vascolare e un archivio in cui le cellule arrestato stravaso di formare micro foci metastatici.
A fini sperimentali, nella maggior parte degli studi recenti la CAM è stata esposta dal taglio di una finestra attraverso il guscio dell'uovo e gli esperimenti sono stati condotti in ovo, con conseguente limitazione significativa l'accessibilità del CAM e le possibilità di osservazione e documentazione fotografica degli effetti. Quando la shell-less culture del embrione di pollo sono stati usati 1-4, nessun dettaglio sperimentale sono state fornite e, se pubblicate in tutti, i tassi di sopravvivenza di queste culture erano basse. Abbiamo raffinato il metodo della cultura ex ovo di embrioni di pollo in modo significativo, introducendo un estrusione razionalmente controllata del contenuto dell'uovo. Queste culture ex ovo migliorare l'accessibilità dell'embrione CAM e pulcino, consentendo un facile nella documentazione in vivo degli effetti e facilitare la manipolazione sperimentale dell'embrione. Questo consente l'applicazione di successo a un gran numero di questioni scientifiche: (1) Come un saggio angiogenesi migliorato 5,6, (2) un set up sperimentale per preparazioni iniettabili facilitato nel vitreo dell'occhio embrione di pollo 7-9, (3) come ambiente di test per la diffusione e intravasation di dispersi cellule tumorali da linee cellulari stabilizzate inoculati sul CAM 10-12, (4), un sistema migliore per sostenere il trapianto di successo e la cultura delle gemme degli arti di pollo e topi 13 come pure (5 ) per l'innesto, propagazione, e ri-innesto di solido tessuto tumorale primaria ottenute da biopsie sulla superficie del CAM 14.
In questo articolo video che descrivono la creazione di una cultura raffinata ex pulcino ovo e test CAM con tassi di sopravvivenza oltre il 50%. Oltre che fornire una dimostrazione passo passo per l'applicazione di successo della cultura ex ovo per un gran numero di applicazioni scientifiche.
Daniel S. Dohle, Susanne D. Pasa, e Sebastian Gustmann contribuito in maniera uguale a questo studio.
Protocol
Discussion
Innovativi o solo un altro protocollo cultura pulcino?
Con l'ex-shell meno protocolli di cultura 1-4 il tasso di sopravvivenza totale degli embrioni pulcino erano basse, ad esempio ca. 30% 1. Il raffinato protocollo cultura ex ovo descritto in questo articolo video, al contrario, permette di tassi di sopravvivenza oltre il 50%. Rispetto al classico nelle culture cultura ex ovo ovo di embrioni di pollo facilita in modo significativo l'a…
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare J. Kueper e J. Wittschier per un'eccellente assistenza tecnica e il Prof. Ruebben generosamente per la fornitura di materiale tumorale.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Fertilized Eggs | Animal | Söries Trockels, Germany | ||
| Mice | Animal | Charles Rivers Laboratories | ||
| Incubator Type 3000 with rotating egg tray | Tools | Siepmann GmbH Germany | 9503 | Maintain at 37°C with relative humidity set above 60% |
| Egg incubator BSS 160 | Tools | Grumbach, Germany | 8101 | Maintain at 37-387deg;C with relative humidity set above 60% |
| PBS | Reagent | Sigma | PBS should be cold (> 4°C) and sterile | |
| Dulbecco’s modified eagle’s medium | Reagent | Sigma | D 6429 | DMEM culture medium |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Reagent | Invitrogen | 31415-029 | here: collection medium for tumor samples |
| Tumor cell -specific medium | Reagent | Sigma | each research group should use the medium they culture their tumors cells in or common culture media, e.g. Leibovitz’s Medium or Dulbecco’s modified eagle’s medium supplemented with 15% fetal bovine serum (FBS), 4mM L-glutamine and 50 μM insulin |
|
| 70% EtOH | Reagent | Sigma | ||
| Magnetic stir bar, triangled 80 mm | Tool | VWR | 442-0391 | A triangled magnetic stir bar serves well to crack the eggs shell. |
| Forceps DUMONT #5 | Tool | Fine Science Tools | 11252-30 | bevelled very fine shanks (0.05 mm x 0.02 mm tip) |
| Forceps DUMONT #7 | Tool | Fine Science Tools | 11271-30 | curved shanks (0.07 mm x 0.10 mm tip) |
| Spring scissors, straight, 8cm | Tool | Fine Science Tools | 15000-00 | fine, small straight blades |
| Fine Iris scissors, straight | Tool | Fine Science Tools | 14094-11 | Use to cut our the CAM |
| Standard scissors, straight, sharp/blunt | Tool | Fine Science Tools | 14007-14 | Use for decapitation or cervical dislocation |
| microliter syringe 1702 TLLX, 25 μl | Tool | Hamilton | 80222 | Use for injection into the vitreous |
| Hamilton 33-G needle (15 mm) | Tool | Fine Science Tools | 18073-15 | Use for injection into the vitreous |
| Sterile scalpels | Tool | Use for dissecting tumor samples | ||
| Small drain spoon | Tool | Geuder, Germany | 15758 | Use to transfer of small chick embryos |
| Wax board with fixing pins | Tool | Self made | Use to fix of animals for dissection | |
| Petri dishes 60 x 15 mm | Tool | Greiner | 628102 | |
| Petri dishes 92 x 16 mm | Tool | Sarstedt | 82.1472 | |
| Sterile Petri dish 100 x 20 mm | Tool | Greiner | 664160 | extra deep, with spacers for ventilation |
| Beaker | Tool | 300-600 ml | ||
| FALCON tubes | Tool | FALCON | 15 ml and 50 ml | |
| Eppendorf tubes | Tool | Eppendorf | 1.5 ml and 2 ml | |
| 1ml pipette tips | Tool | Use to cut plastic rings for application of substances / cells | ||
| Peripheral venous catheter (PVL) | Tool | Viggo® | Use to cut silicon rings from the tube for application of substances / cells | |
| Pipettes and tips | Tool | Eppendorf / Abimed | ||
| Autoclaved folded Filters 595 1/2, 110 mm diameter | Tool | Schleicher & Schuell | 311643 | Carrier, which caused least irritation of the CAM; used in the paper |
| PTFE-Pledget, non resorbing, 6,3 x 152.4 x 1.6 mm | Tool | santec-medical | REF 277, LOT 832/511-1 | Carrier; caused false positive results |
| Hxdroxyethylcellulose Tylose H 100000 | Reagent | Carrier mixed with Kollidon 17 PF; caused false positive results | ||
| Kollidon 17 PF | Reagent | BASF | S30200 | mixed with Hydroxyethylcellulose; caused false positive results |
| Collagen Biomatrix TissuDura | Tool | Baxter Healthcare S.A. | REF B2246000999999 | Carrier; caused false positive results |
| Round glass cover slips, 11 mm | Tool | Assistent Germany | 1001/0011 | Carrier; causes false positive results |
| Bovine Collagen Sponge | Tool | Wyeth | Carrier; caused false positive results | |
| Resodont Absorbable Collagen Membrane | Tool | Resorba Woundcare Germany | LOT 280303 | Carrier; caused false positive results |
| Non-Woven Swabs | Tool | Fink & Walter GmbH | REF 328132 | Carrier; caused false positive results |
Referências
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