チック EX卵文化と EX卵 CAMアッセイ：それが実際にどのように動く
Summary
ニワトリ漿尿膜（CAM）は、血管新生と腫瘍形成を研究するユニークな、自然に免疫不全支える文化環境です。このビデオの記事では、ニワトリの異なるステップを示しています<em> EX卵</em>文化、潜在的に血管新生物質の応用とCAMの表面上の腫瘍細胞や組織の成功を接種。
Abstract
繁殖の初期段階での鶏の卵は、in vitroおよび in vivo の系での間にあると血管新生を研究するだけでなく、腫瘍形成を研究するだけでなく、血管のテスト環境を提供しています。ニワトリ漿尿膜（CAM）が開発された後、その血管のネットワークを簡単に、アクセス操作や観察、したがって、血管新生アッセイの最適な設定を提供することができます。リンパ系が完全にインキュベーションの後期段階まで開発されていないので、ニワトリ胚では、種特異的制限なしに移植された組織や細胞を維持できる自然に免疫不全宿主の役割を果たします。同種および異種移植の開発育成に加えて、CAMの血管のネットワークは、腫瘍細胞の脈管内へ、普及、および血管の逮捕と逮捕の細胞はミクロ転移巣を形成するために浸出リポジトリの一意な環境を提供します。
実験的な目的のために、CAMが卵の殻と実験により、ウィンドウを切断することによって露出された最近の研究のほとんどに効果の観察と写真ドキュメンテーションのためのCAMとの可能性のアクセシビリティの重要な制限の結果、OVOで実施された。ニワトリ胚の殻のない文化が1-4を使用した場合に、実験的な詳細はまったく公開されている場合は、提供されないとされ、これらの培養物の生存率は低かった。私たちは、卵のコンテンツの合理的制御押し出しを導入することにより、大幅にニワトリ胚の元OVO文化の方法を精緻化。これらの元OVOの文化は、効果のin vivoでのドキュメントに簡単に有効化および胚の実験的操作を容易に、CAMおよびニワトリ胚のアクセシビリティを向上させる。ニワトリ胚の眼7-9の硝子体に容易に注射のために設定（1）改良された血管新生アッセイ5,6として、（2）実験、（3）：これは、科学的な質問の多数に成功したアプリケーションを可能に成功した移植と文化鶏肉やマウス13の肢芽のほか、（5のための改善、持続性のあるシステムとしてCAM 10-12接種樹立した細胞株から分散した腫瘍細胞、（4）の普及と管内のためのテスト環境として）、伝播を移植し、カム14の表面上に生検から得られた固形原発腫瘍組織の再移植のための。
このビデオの記事では、洗練されたひよこの元OVO文化と50％以上の生存率とCAMアッセイの確立について説明します。加えて我々は科学的な多数のアプリケーションのための元OVO文化の成功したアプリケーションのステップのデモンストレーションで手順を提供します。
ダニエルS. Dohle、スザンヌD.パシャ、とセバスチャンGustmannはこの研究にも同様に貢献した。
Protocol
すべての機器および試薬は、滅菌購入する必要がありますまたは熱または蒸気滅菌または70％エタノールで滅菌する必要があります。 動物実験は動物実験で定められている実験的な手続きと規制のための動物の管理と使用に関するNIHのガイドラインに従って、欧州共同体理事会指令（86/609/EEC）に準拠して行われたという著者らの状態ケアとデュースブルク – エッセ?…
Discussion
革新的なまたは単に別のひよこの文化のプロトコル？
旧シェルレス文化プロトコルでニワトリ胚1-4総生存率は、例えば約低かった。 30パーセント1。このビデオの記事で説明されている洗練された元OVO文化のプロトコルは、対照的に、50％以上の生存率が可能になります。ニワトリ胚の卵文化の古典的な元OVO培養物と比較して大?…
Acknowledgements
著者は、寛大に腫瘍材料を供給するための優れた技術支援と教授RuebbenのためJ. KueperとJ. Wittschierに感謝します。
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Fertilized Eggs | Animal | Söries Trockels, Germany | ||
| Mice | Animal | Charles Rivers Laboratories | ||
| Incubator Type 3000 with rotating egg tray | Tools | Siepmann GmbH Germany | 9503 | Maintain at 37°C with relative humidity set above 60% |
| Egg incubator BSS 160 | Tools | Grumbach, Germany | 8101 | Maintain at 37-387deg;C with relative humidity set above 60% |
| PBS | Reagent | Sigma | PBS should be cold (> 4°C) and sterile | |
| Dulbecco’s modified eagle’s medium | Reagent | Sigma | D 6429 | DMEM culture medium |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Reagent | Invitrogen | 31415-029 | here: collection medium for tumor samples |
| Tumor cell -specific medium | Reagent | Sigma | each research group should use the medium they culture their tumors cells in or common culture media, e.g. Leibovitz’s Medium or Dulbecco’s modified eagle’s medium supplemented with 15% fetal bovine serum (FBS), 4mM L-glutamine and 50 μM insulin |
|
| 70% EtOH | Reagent | Sigma | ||
| Magnetic stir bar, triangled 80 mm | Tool | VWR | 442-0391 | A triangled magnetic stir bar serves well to crack the eggs shell. |
| Forceps DUMONT #5 | Tool | Fine Science Tools | 11252-30 | bevelled very fine shanks (0.05 mm x 0.02 mm tip) |
| Forceps DUMONT #7 | Tool | Fine Science Tools | 11271-30 | curved shanks (0.07 mm x 0.10 mm tip) |
| Spring scissors, straight, 8cm | Tool | Fine Science Tools | 15000-00 | fine, small straight blades |
| Fine Iris scissors, straight | Tool | Fine Science Tools | 14094-11 | Use to cut our the CAM |
| Standard scissors, straight, sharp/blunt | Tool | Fine Science Tools | 14007-14 | Use for decapitation or cervical dislocation |
| microliter syringe 1702 TLLX, 25 μl | Tool | Hamilton | 80222 | Use for injection into the vitreous |
| Hamilton 33-G needle (15 mm) | Tool | Fine Science Tools | 18073-15 | Use for injection into the vitreous |
| Sterile scalpels | Tool | Use for dissecting tumor samples | ||
| Small drain spoon | Tool | Geuder, Germany | 15758 | Use to transfer of small chick embryos |
| Wax board with fixing pins | Tool | Self made | Use to fix of animals for dissection | |
| Petri dishes 60 x 15 mm | Tool | Greiner | 628102 | |
| Petri dishes 92 x 16 mm | Tool | Sarstedt | 82.1472 | |
| Sterile Petri dish 100 x 20 mm | Tool | Greiner | 664160 | extra deep, with spacers for ventilation |
| Beaker | Tool | 300-600 ml | ||
| FALCON tubes | Tool | FALCON | 15 ml and 50 ml | |
| Eppendorf tubes | Tool | Eppendorf | 1.5 ml and 2 ml | |
| 1ml pipette tips | Tool | Use to cut plastic rings for application of substances / cells | ||
| Peripheral venous catheter (PVL) | Tool | Viggo® | Use to cut silicon rings from the tube for application of substances / cells | |
| Pipettes and tips | Tool | Eppendorf / Abimed | ||
| Autoclaved folded Filters 595 1/2, 110 mm diameter | Tool | Schleicher & Schuell | 311643 | Carrier, which caused least irritation of the CAM; used in the paper |
| PTFE-Pledget, non resorbing, 6,3 x 152.4 x 1.6 mm | Tool | santec-medical | REF 277, LOT 832/511-1 | Carrier; caused false positive results |
| Hxdroxyethylcellulose Tylose H 100000 | Reagent | Carrier mixed with Kollidon 17 PF; caused false positive results | ||
| Kollidon 17 PF | Reagent | BASF | S30200 | mixed with Hydroxyethylcellulose; caused false positive results |
| Collagen Biomatrix TissuDura | Tool | Baxter Healthcare S.A. | REF B2246000999999 | Carrier; caused false positive results |
| Round glass cover slips, 11 mm | Tool | Assistent Germany | 1001/0011 | Carrier; causes false positive results |
| Bovine Collagen Sponge | Tool | Wyeth | Carrier; caused false positive results | |
| Resodont Absorbable Collagen Membrane | Tool | Resorba Woundcare Germany | LOT 280303 | Carrier; caused false positive results |
| Non-Woven Swabs | Tool | Fink & Walter GmbH | REF 328132 | Carrier; caused false positive results |
Referências
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Citar este artigo
Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Dünker, N. Chick ex ovo Culture and ex ovo CAM Assay: How it Really Works. J. Vis. Exp. (33), e1620, doi:10.3791/1620 (2009).