Den chick chorioallantoic membran (CAM) är ett unikt, naturligt immunförsvar stödjande kultur miljö att studera angiogenes och Tumörgenesens. Denna video artikeln visar de olika stegen i chick<em> Ex ovo</em> Kultur, tillämpning av potentiellt angiogena ämnen och framgångsrik ympning av tumör celler och vävnader på ytan av CAM.
Kyckling ägg i den tidiga fasen av avel är mellan in vitro och in vivo-system och ger en vaskulär testmiljö inte bara att studera angiogenes, utan också för att studera Tumörgenesens. Efter chick chorioallantoic membran (CAM) har utvecklat, kan dess blodkärl nätverk är lättillgängliga, manipuleras och observerade och därför ger en optimal miljö för angiogenes analyser. Eftersom det lymfoida systemet inte är fullt utvecklat förrän i slutet stadier av inkubation, tjänar kycklingembryo som ett naturligt immunförsvar värd klara av transplanterade vävnader och celler utan artspecifika restriktioner. Förutom att vårda utveckla allo-och implanterad ger CAM blodkärl nätverk ett unikt stödjande miljö för tumörceller intravasation, spridning, och vaskulär gripandet och ett arkiv där greps celler extravasera att bilda mikro metastashärdar.
För försöksändamål, i de flesta av de senaste studierna CAM avslöjades genom att skära ett fönster genom äggskalet och experimenten utfördes i ovo, resulterar i betydande begränsningar i tillgängligheten av CAM och möjligheter för observation och fotodokumentation av effekter. När skalet mindre kulturer kycklingembryo användes 1-4, inga experimentella uppgifter och, om offentliggöras vid alla var överlevnaden för dessa kulturer låg. Vi förfinade metoden för ex ovo kultur kycklingembryon avsevärt genom att införa ett rationellt kontrollerad extrudering av ägget innehåll. Dessa ex ovo kulturer öka tillgängligheten till CAM och kycklingembryo, vilket gör det lätt in vivo dokumentation av effekter och underlätta experimentell manipulation av embryot. Detta möjliggör en framgångsrik ansökan till ett stort antal vetenskapliga frågor: (1) Som en förbättrad angiogenes analys 5,6, (2) en experimentell inrättats för underlättat injektioner i glaskroppen för kycklingembryo ögat 7-9, (3) som en testmiljö för spridning och intravasation av spridda tumörceller från etablerade cellinjer inokuleras på CAM 10-12, (4), ett förbättrat upprätthålla system för lyckad transplantation och kultur lem knoppar av kyckling och möss 13 samt (5 ) för ympning, förökning, och åter ympning av fast primära tumörvävnad från biopsier på ytan av CAM 14.
I denna video artikeln beskriver vi inrättandet av en raffinerad chick ex ovo kultur-och CAM-analysen med överlevnad över 50%. Förutom att vi erbjuder en steg för steg demonstration av framgångsrik tillämpning av ex ovo kultur för ett stort antal vetenskapliga applikationer.
Daniel S. Dohle, Susanne D. Pasa, och Sebastian Gustmann bidragit lika för denna studie.
Innovativ eller bara en annan brud kultur-protokollet?
Med tidigare skal mindre kultur protokollen 1-4 den totala överlevnaden av kycklingembryon var låga, t ex ca. 30% 1. Den raffinerade ex ovo kultur protokoll som beskrivs i denna video artikeln, däremot möjliggör överlevnad över 50%. Jämfört med klassisk ovo kulturer ex ovo kultur kycklingembryon underlättar avsevärt tillgänglighet CAM och kycklingembryo och gör sin experimente…
Författarna vill tacka J. Kueper och J. Wittschier för utmärkt tekniskt bistånd och professor Ruebben för generöst leverera tumörvävnad.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Fertilized Eggs | Animal | Söries Trockels, Germany | ||
Mice | Animal | Charles Rivers Laboratories | ||
Incubator Type 3000 with rotating egg tray | Tools | Siepmann GmbH Germany | 9503 | Maintain at 37°C with relative humidity set above 60% |
Egg incubator BSS 160 | Tools | Grumbach, Germany | 8101 | Maintain at 37-387deg;C with relative humidity set above 60% |
PBS | Reagent | Sigma | PBS should be cold (> 4°C) and sterile | |
Dulbecco’s modified eagle’s medium | Reagent | Sigma | D 6429 | DMEM culture medium |
Leibovitz’s L-15 Medium | Reagent | Invitrogen | 31415-029 | here: collection medium for tumor samples |
Tumor cell -specific medium | Reagent | Sigma | each research group should use the medium they culture their tumors cells in or common culture media, e.g. Leibovitz’s Medium or Dulbecco’s modified eagle’s medium supplemented with 15% fetal bovine serum (FBS), 4mM L-glutamine and 50 μM insulin |
|
70% EtOH | Reagent | Sigma | ||
Magnetic stir bar, triangled 80 mm | Tool | VWR | 442-0391 | A triangled magnetic stir bar serves well to crack the eggs shell. |
Forceps DUMONT #5 | Tool | Fine Science Tools | 11252-30 | bevelled very fine shanks (0.05 mm x 0.02 mm tip) |
Forceps DUMONT #7 | Tool | Fine Science Tools | 11271-30 | curved shanks (0.07 mm x 0.10 mm tip) |
Spring scissors, straight, 8cm | Tool | Fine Science Tools | 15000-00 | fine, small straight blades |
Fine Iris scissors, straight | Tool | Fine Science Tools | 14094-11 | Use to cut our the CAM |
Standard scissors, straight, sharp/blunt | Tool | Fine Science Tools | 14007-14 | Use for decapitation or cervical dislocation |
microliter syringe 1702 TLLX, 25 μl | Tool | Hamilton | 80222 | Use for injection into the vitreous |
Hamilton 33-G needle (15 mm) | Tool | Fine Science Tools | 18073-15 | Use for injection into the vitreous |
Sterile scalpels | Tool | Use for dissecting tumor samples | ||
Small drain spoon | Tool | Geuder, Germany | 15758 | Use to transfer of small chick embryos |
Wax board with fixing pins | Tool | Self made | Use to fix of animals for dissection | |
Petri dishes 60 x 15 mm | Tool | Greiner | 628102 | |
Petri dishes 92 x 16 mm | Tool | Sarstedt | 82.1472 | |
Sterile Petri dish 100 x 20 mm | Tool | Greiner | 664160 | extra deep, with spacers for ventilation |
Beaker | Tool | 300-600 ml | ||
FALCON tubes | Tool | FALCON | 15 ml and 50 ml | |
Eppendorf tubes | Tool | Eppendorf | 1.5 ml and 2 ml | |
1ml pipette tips | Tool | Use to cut plastic rings for application of substances / cells | ||
Peripheral venous catheter (PVL) | Tool | Viggo® | Use to cut silicon rings from the tube for application of substances / cells | |
Pipettes and tips | Tool | Eppendorf / Abimed | ||
Autoclaved folded Filters 595 1/2, 110 mm diameter | Tool | Schleicher & Schuell | 311643 | Carrier, which caused least irritation of the CAM; used in the paper |
PTFE-Pledget, non resorbing, 6,3 x 152.4 x 1.6 mm | Tool | santec-medical | REF 277, LOT 832/511-1 | Carrier; caused false positive results |
Hxdroxyethylcellulose Tylose H 100000 | Reagent | Carrier mixed with Kollidon 17 PF; caused false positive results | ||
Kollidon 17 PF | Reagent | BASF | S30200 | mixed with Hydroxyethylcellulose; caused false positive results |
Collagen Biomatrix TissuDura | Tool | Baxter Healthcare S.A. | REF B2246000999999 | Carrier; caused false positive results |
Round glass cover slips, 11 mm | Tool | Assistent Germany | 1001/0011 | Carrier; causes false positive results |
Bovine Collagen Sponge | Tool | Wyeth | Carrier; caused false positive results | |
Resodont Absorbable Collagen Membrane | Tool | Resorba Woundcare Germany | LOT 280303 | Carrier; caused false positive results |
Non-Woven Swabs | Tool | Fink & Walter GmbH | REF 328132 | Carrier; caused false positive results |