Civciv Ex ovo Kültür ve Ex ovo CAM Testi: Gerçekten Nasıl Çalışır?
Summary
Civciv chorioallantoic membran (CAM), anjiyogenez ve tümörogenez çalışmak için eşsiz bir doğal bağışık yetmezliği olan, destekleyici bir kültür ortamı. Bu video makale piliç farklı adımları gösteriyor.<em> Ex ovo</em> Kültür, potansiyel anjiyogenik maddeler ve CAM yüzeyinde tümör hücre ve dokuların başarılı aşılama uygulaması.
Abstract
Islah erken dönemde tavuk yumurtası, in vitro ve in vivo sistemleri arasında ve anjiyogenez okumak için değil, aynı zamanda tümörogenez çalışma sadece vasküler bir test ortamı sağlamak . Civciv chorioallantoic membran (CAM) sonra, kan damarı ağına kolayca erişilen manipüle ve gözlenen ve bu nedenle anjiyogenez deneyleri için uygun bir ortam sağlar. Lenfoid sistem tamamen inkübasyon geç evrelerine kadar gelişmemiş olduğundan, civciv embriyo türe özgü bir kısıtlama olmaksızın aşılı doku ve hücreler sürdürme yeteneğine doğal bağışık yetmezliği olan bir ev sahibi olarak hizmet vermektedir. Gelişmekte olan besleyici ek olarak allo ve xenografts, CAM kan damarı ağı, tümör hücresi intravasation, dağıtılması, ve damar tutuklandı hücrelerin mikro metastatik odaklar oluşturmak için extravasate tutuklanması ve bir depo için benzersiz bir destekleyici bir ortam sağlar.
Deneysel amaçlar için, son çalışmalar en CAM yumurta kabuğu ile bir pencere kesme ve deneyler, gözlem ve etkileri fotoğraf dokümantasyon imkanları CAM ve erişilebilirliğini önemli sınırlamalar, ovo yapılmıştır maruz kalmıştır . Civciv embriyo kabuk az kültürleri 1-4 kullanıldığı zaman, eğer yayınlanan hiçbir deneysel ayrıntıları, sağlanan ve bu kültürlerin sağkalım oranları oldukça düşüktür. Biz yumurta içeriğini bir rasyonel kontrollü ekstrüzyon tanıtarak civciv embriyo ex ovo kültürünün önemli yöntem rafine. Bu ex ovo kültürlerinin etkileri in vivo belgelerinde kolay sağlayan ve embriyo deneysel manipülasyon kolaylaştırılması, CAM ve civciv embriyo erişilebilirliğini artırmak. Bu bilimsel soruların çok sayıda başarılı uygulama sağlar: (1) tahlil 5,6 olarak geliştirilmiş bir anjiyogenez, (2) deneysel (3), 7-9 civciv embriyo göz vitreus kolaylaştırdı enjeksiyonlar için ayarlamak yaygınlaştırılması ve intravasation için bir test ortamı (5 CAM 10-12 inoküle kurulan hücre hatları tümör hücrelerinin, (4), tavuk ve fareler 13 de bacak tomurcukları başarılı transplantasyon ve kültürünün sürdürülmesi için geliştirilmiş bir sistem olarak dağınık olarak , aşılama, yayılımı, ve CAM (14) yüzeyinde biyopsilerinde elde edilen katı primer tümör dokusunun yeniden aşılama) .
Bu video makalede rafine civciv ex ovo kültür ve CAM sağkalım oranları% 50 üzerinde tahlil kurulması açıklanmaktadır. Ayrıca, çok sayıda bilimsel uygulamaları için ex ovo kültürünün başarılı bir uygulama adım gösteri bir adım sağlar .
Daniel S. Dohle, Susanne D. Paşa ve Sebastian Gustmann Bu çalışmada eşit katkıda bulunmuştur.
Protocol
Discussion
Yenilikçi ya da sadece başka bir civciv kültür protokolü?
Eski kabuk kültür protokolleri ile civciv embriyo 1-4 toplam sağkalım oranları, örneğin ca düşüktü. % 30 1. Bu video makalede açıklanan rafine ex ovo kültür protokolü aksine,% 50'nin üzerinde sağkalım oranları sağlar. Civciv embriyo ovo kültürlerin klasik karşılaştırıldığında ex ovo kültürü CAM ve civciv embriyo erişilebilirliğini ö…
Acknowledgements
Yazarlar cömertçe tümör malzeme temini için mükemmel teknik destek ve Prof. Ruebben J. Kueper ve J. Wittschier teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Fertilized Eggs | Animal | Söries Trockels, Germany | ||
| Mice | Animal | Charles Rivers Laboratories | ||
| Incubator Type 3000 with rotating egg tray | Tools | Siepmann GmbH Germany | 9503 | Maintain at 37°C with relative humidity set above 60% |
| Egg incubator BSS 160 | Tools | Grumbach, Germany | 8101 | Maintain at 37-387deg;C with relative humidity set above 60% |
| PBS | Reagent | Sigma | PBS should be cold (> 4°C) and sterile | |
| Dulbecco’s modified eagle’s medium | Reagent | Sigma | D 6429 | DMEM culture medium |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Reagent | Invitrogen | 31415-029 | here: collection medium for tumor samples |
| Tumor cell -specific medium | Reagent | Sigma | each research group should use the medium they culture their tumors cells in or common culture media, e.g. Leibovitz’s Medium or Dulbecco’s modified eagle’s medium supplemented with 15% fetal bovine serum (FBS), 4mM L-glutamine and 50 μM insulin |
|
| 70% EtOH | Reagent | Sigma | ||
| Magnetic stir bar, triangled 80 mm | Tool | VWR | 442-0391 | A triangled magnetic stir bar serves well to crack the eggs shell. |
| Forceps DUMONT #5 | Tool | Fine Science Tools | 11252-30 | bevelled very fine shanks (0.05 mm x 0.02 mm tip) |
| Forceps DUMONT #7 | Tool | Fine Science Tools | 11271-30 | curved shanks (0.07 mm x 0.10 mm tip) |
| Spring scissors, straight, 8cm | Tool | Fine Science Tools | 15000-00 | fine, small straight blades |
| Fine Iris scissors, straight | Tool | Fine Science Tools | 14094-11 | Use to cut our the CAM |
| Standard scissors, straight, sharp/blunt | Tool | Fine Science Tools | 14007-14 | Use for decapitation or cervical dislocation |
| microliter syringe 1702 TLLX, 25 μl | Tool | Hamilton | 80222 | Use for injection into the vitreous |
| Hamilton 33-G needle (15 mm) | Tool | Fine Science Tools | 18073-15 | Use for injection into the vitreous |
| Sterile scalpels | Tool | Use for dissecting tumor samples | ||
| Small drain spoon | Tool | Geuder, Germany | 15758 | Use to transfer of small chick embryos |
| Wax board with fixing pins | Tool | Self made | Use to fix of animals for dissection | |
| Petri dishes 60 x 15 mm | Tool | Greiner | 628102 | |
| Petri dishes 92 x 16 mm | Tool | Sarstedt | 82.1472 | |
| Sterile Petri dish 100 x 20 mm | Tool | Greiner | 664160 | extra deep, with spacers for ventilation |
| Beaker | Tool | 300-600 ml | ||
| FALCON tubes | Tool | FALCON | 15 ml and 50 ml | |
| Eppendorf tubes | Tool | Eppendorf | 1.5 ml and 2 ml | |
| 1ml pipette tips | Tool | Use to cut plastic rings for application of substances / cells | ||
| Peripheral venous catheter (PVL) | Tool | Viggo® | Use to cut silicon rings from the tube for application of substances / cells | |
| Pipettes and tips | Tool | Eppendorf / Abimed | ||
| Autoclaved folded Filters 595 1/2, 110 mm diameter | Tool | Schleicher & Schuell | 311643 | Carrier, which caused least irritation of the CAM; used in the paper |
| PTFE-Pledget, non resorbing, 6,3 x 152.4 x 1.6 mm | Tool | santec-medical | REF 277, LOT 832/511-1 | Carrier; caused false positive results |
| Hxdroxyethylcellulose Tylose H 100000 | Reagent | Carrier mixed with Kollidon 17 PF; caused false positive results | ||
| Kollidon 17 PF | Reagent | BASF | S30200 | mixed with Hydroxyethylcellulose; caused false positive results |
| Collagen Biomatrix TissuDura | Tool | Baxter Healthcare S.A. | REF B2246000999999 | Carrier; caused false positive results |
| Round glass cover slips, 11 mm | Tool | Assistent Germany | 1001/0011 | Carrier; causes false positive results |
| Bovine Collagen Sponge | Tool | Wyeth | Carrier; caused false positive results | |
| Resodont Absorbable Collagen Membrane | Tool | Resorba Woundcare Germany | LOT 280303 | Carrier; caused false positive results |
| Non-Woven Swabs | Tool | Fink & Walter GmbH | REF 328132 | Carrier; caused false positive results |
Referências
- Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. A simple procedure for long-term cultivation of chicken embryos. Dev. Biol. 41, 391-394 (1974).
- Tufan, A. C., Akdogan, I., Adiguzel, E. Shell-less culture of the chick embryo as a model system in the study of development neurobiology. Neuroanatomy. 3, 8-11 (2004).
- Deryugina, E. I., Quigley, J. P. Chick embryo chorioallantoic membrane models to quantify angiogenesis induced by inflammatory and tumor cells or purified effector molecules. Methods Enzymology. 444, 21-44 (2008).
- Ribatti, D. Chick embryo chorioallantoic membrane as a useful tool to study angiogenesis. Int. Rev. Cell Mol. Biol. 270, 181-224 (2008).
- Höckel, M., Sasse, J., Wissler, J. H. Purified monocyte-derived angiogenic substance (angiotropin) stimulates migration, phenotypic changes, and “tube formation” but not proliferation of capillary endothelial cells in vitro. J. Cell Physiol. 133, 1-13 (1987).
- Wissler, J. H. Engineering of blood vessel patterns by Angio Morphogens [Angiotropins]. Materialwiss. Werkstofftech. 32, 984-1008 (2001).
- Kistler, H. B. . J. r. .., LaVail, J. H. Penetration of horseradish peroxidase into the optic nerve after vitreal or vascular injections in the developing chick. Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 20, 705-716 (1981).
- Halfter, W. Change in embryonic eye size and retinal cell proliferation following intravitreal injection of glycosaminoglycans. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 49, 3289-3298 (2008).
- Oppitz, M., Busch, C., Shriek, G., Metzger, M., Just, L., Drews, U. Non-malignant migration of B16 mouse melanoma cells in the neural crest and invasive growth in the eye cup of the chick embryo. Melanoma Res. 17, 17-30 (2007).
- Uchibayashi, T., Egawa, M., Nakajima, K., Hisazumi, H., Tanaka, M., Endo, Y., Sasaki, T. Responses of tumour cell lines implanted onto the chorioallantoic membrane of chick embryo to anticancer agents in combination with hyperthermia. Urol. Res. 20, 237-239 (1992).
- Demir, R., Naschberger, L., Demir, I., Melling, N., Dimmler, A., Papadopoulus, T., Sturzl, M., Klein, P., Hohenberger, W. Hypoxia generates a more invasive phenotype of tumour cells: an in vivo experimental setup based on the chorioallantoic membrane. Pathol. Oncol. Res. , (2008).
- Kunzi-Rapp, K., Genze, F., Kufer, R., Reich, E., Hautmann, R. E., Gschwend, J. E. Chorioallantoic membrane assay: vascularized 3-dimensional cell culture system for human prostate cancer cells as an animal substitute model. J. Urol. 166, 1502-1507 (2001).
- Hall, B. K. Grafting of organs and tissues to the chorioallantoic membrane of the embryonic chick. TCA Manual. 4 (3), 881-883 (1978).
- Kunzi-Rapp, K., Kaskel, P., Steiner, R., Peter, R. U., Krahn, G. Increased blood levels of human S100 in melanoma chick embryo xenografts’ circulation. Pigment Cell Res. 14, 9-13 (2001).
- McFall, R. C., Sery, T. W., Makadon, M. Characterization of a new continuous cell line derived from a human retinoblastoma. Pesquisa do Câncer. 37, 1003-1010 (1977).
- Deryugina, E. I., Zijlstra, A., Partridge, J. J., Kupriyanova, T. A., Madsen, M. A., Papagiannakopoulos, T., Quigley, J. P. Unexpected effect of matrix metalloproteinase down-regulation on vascular intravasation and metastasis of human fibrosarcoma cells selected in vivo for high rates of dissemination. Pesquisa do Câncer. 65, 10959-10969 (2005).
- Kim, J., Kovalski, K., Ossowski, L. requirement for specific proteases in cancer cell intravasation as revealed by a novel semiquantitative PCR-based assay. Cell. 94, 353-362 (1998).
