ヒトmRNA前駆体上にマッピングリボ核の迅速なハイスループット法（RNPS）

Summary

pre – mRNAの一過性の性質のため、それは分離が困難になると勉強することができます<em> in vivoで</em>。ここで、我々は、小説を提示<em> in vitroで</empre – mRNAの選択された地域間のタイル、合成オリゴプールを使用してRNA -タンパク質相互作用を調査する>アプローチ。

Abstract

RNA結合タンパク質との共免疫沈降（CO – IP）は、その結合位置を示すことによってスプライシングの我々の理解を増加していることをRNAをシーケンシングすることは、しばしばスプライシング因子の機能に影響を与えます。しかし、任意のサンプリングの戦略と同様にスプライシング因子に結合したRNAを識別するためのチャンスは、その細胞が豊富に比例する。我々は、pre – mRNAのそうでなければ、一時的に結合特異性を調査するためのin vitroでのアプローチで小説を開発している。このアプローチは、イントロン、エクソン、スプライスジャンクショ​​ン、またはpre – mRNAの他の間のタイルその特別に設計されたオリゴヌクレオチドのプールを利用しています。プールは、分子の選択のいくつかの種類に供される。ここでは、バインドおよび非バインド画分にオリゴヌクレオチドを​​分離することによって方法を示し、結合画分中の各オリゴヌクレオチドの濃縮を記録するには、2つの色の配列の戦略をたてて行う。配列データは、配列特異的および構造のpre – mRNAに結合リボ核タンパク質（RNP）のdeterminates識別する能力と高解像度のマップを生成します。プールは特別に設計されたとのpre – mRNAの配列から合成されるこの方法に固有の利点は、現在のIPとSELEX技術に関連するmRNAに向かって、サンプリングバイアスを避けるためにできることです。実験者は、個々のニーズにプールに仕立て、全体の研究やタイルにどの地域を選択するので、オリゴヌクレオチドプールの柔軟性は別の利点です。このテクニックを使用して、一つはアッセイ大規模に結合または機能的なスプライシングレポーターにライブラリのクローンを作成し、付属の画分に濃縮されているオリゴヌクレオチドを​​識別する上で多型または変異の影響をすることができます。 in vitroでの高解像度のマッピングスキームでこの小説は、低濃度生体技術の現在と一緒に勉強するためにそれらを困難にする一時的なpre – mRNAの種、とRNP相互作用を研究するユニークな方法を提供します。

Protocol

プールの設計とオリゴ回復最初のステップは、検討するのpre – mRNAのプールを設計することです。これは、UCSCゲノムブラウザを使用して、特定の遺伝子、スプライスジャンクショ​​ン、またはその他のテーマをダウンロードし実行することができます。 興味のあるウィンドウを選択したら、計算上、次の条件を使用してそれらの間のタイル：長さを読み取るには、各オリゴは…

Discussion

プールのその作成を覚えてこの手順を、その重要を行うときには、RNAまたはタンパク質のレベルのいずれかで柔軟性があり、変更に開いています。 RNAレベルでオルソロガス地域、病気の変異、多型、またはランダム突然変異はオリゴヌクレオチド配列を導入することができる。タンパク質レベルでのRNA結合因子は、リン酸化または他の翻訳後修飾によって変更することができます。また、束…