En snabb hög kapacitet metod för kartläggning Ribonucleoproteins (RNPs) om mänskliga pre-mRNA
Summary
På grund av övergående natur pre-mRNA, kan det vara svårt att isolera och studera<em> In vivo</em>. Här presenterar vi en ny<em> In vitro</em> Tillvägagångssätt för att undersöka RNA-protein växelverkan med hjälp av en syntetisk oligo pool som brickor i utvalda regioner av pre-mRNA.
Abstract
Sekvensering RNA att samarbetet immunoprecipitate (co-IP) med RNA-bindande proteiner har ökat vår förståelse för skarvning genom att visa att bindande platsen ofta påverkar funktionen av en skarvning faktor. Men som med alla provtagningsstrategi chansen att identifiera en RNA bunden till en skarvning faktor är proportionell mot dess cell överflöd. Vi har utvecklat en ny in vitro metod för kartläggning bindande specificitet för övrigt övergående pre-mRNA. Denna metod använder en särskilt utformad oligonukleotid pool som kakel över introner, exoner, korsningar skarva eller andra pre-mRNA. Poolen är utsatt för någon form av molekylära urval. Här visar vi metoden genom att separera oligonukleotiden in i en bunden och obundna fraktionen och använda en två strategiska färg array för att registrera anrikning av varje oligonukleotid i den bundna fraktionen. Matrisen uppgifter ger upphov till högupplösta kartor med förmåga att identifiera sekvensspecifika och strukturella determinates av ribonucleoprotein (RNP) bindande för pre-mRNA. En unik fördel med denna metod är dess förmåga att undvika provtagning inriktning mot mRNA i samband med dagens IP och tekniker SELEX, eftersom poolen är särskilt utformade och syntetiseras från pre-mRNA sekvens. Flexibiliteten i oligonukleotiden poolen är en annan fördel eftersom försöksledaren väljer vilka regioner att studera och kakel över, sömnad poolen till deras individuella behov. Med denna teknik kan en analys av effekterna av polymorfismer eller mutationer på bindande i stor skala eller klona biblioteket till en funktionell skarvning reporter och identifiera oligonukleotider som anrikas i den medföljande fraktion. Denna nya in vitro högupplösta kartläggningssystem erbjuder ett unikt sätt att studera RNP interaktioner med övergående pre-mRNA arter, vars låga överflöd gör dem svåra att studera med dagens in vivo tekniker.
Protocol
Discussion
När du gör detta förfarande det viktigt att komma ihåg att skapandet av poolen är flexibel och öppen för förändring antingen RNA eller protein nivå. Vid RNA-nivå orthologous regioner, mutationer sjukdom, polymorfismer, eller slumpmässiga mutationer kan föras in i oligonukleotid sekvensen. På proteinnivå RNA-bindande faktorn kan ändras genom fosforylering eller andra inlägg translationella modifieringar. Dessutom kan bindande miljö manipuleras för att antingen öka eller minska nivåerna av ytterligare…
