Genetic Studies of Human DNA-Reparatur-Proteinen unter Verwendung von Hefe als Modellsystem
Summary
Genetische Studien in Hefe kann eingesetzt werden, um die molekularen und zellulären Funktionen der menschlichen Gene in Zellen DNA-Stoffwechsel zu untersuchen. Es werden Methoden für die genetische Charakterisierung des menschlichen beschrieben<em> WRN</em> Genprodukt defekt in der vorzeitigen Alterung Störung Werner-Syndrom in funktionell konserviert Wege unter Verwendung von Hefe als handhabbar Modellsystem.
Abstract
Das Verständnis der Rolle der menschlichen DNA-Reparatur-Proteine in genetischen Ursachen ist eine gewaltige Herausforderung für viele Forscher. Genetische Studien in Säugetier-Systeme wurden aufgrund des Fehlens von leicht verfügbaren Tools, einschließlich definiert mutierten genetischen Zelllinien, regulatorische Ausdruck Systeme und entsprechende Selektionsmarker begrenzt. Zur Umgehung dieser Schwierigkeiten haben Modell genetische Systeme in niederen Eukaryoten zu einer attraktiven Wahl für das Studium der funktionell konservierten DNA-Reparatur-Proteine und Signalwege. Wir haben ein Modell Hefe-System, um die schlecht definierten genetischen Funktionen der Werner-Syndrom Helikase-Nuklease-Studie entwickelt (<em> WRN</em>) In Nukleinsäurestoffwechsel. Cellular Phänotypen mit definierten genetischen Mutanten Hintergründen verbunden sind, können untersucht werden, um die zellulären und molekularen Funktionen zu klären<em> WRN</em> Durch ihre katalytischen Aktivitäten und Protein-Interaktionen. Der menschliche<em> WRN</em> Gen und die damit verbundenen Varianten in DNA-Plasmide für die Expression in Hefe kloniert, kann unter der Kontrolle eines regulatorischen Plasmid-Element platziert werden. Der Ausdruck Konstrukt kann dann in die entsprechenden Hefemutante Hintergrund und genetische Funktion durch eine Vielzahl von Methoden untersucht umgewandelt werden. Mit diesem Ansatz haben wir festgestellt, dass<em> WRN</em>, Wie die damit verbundenen RecQ Familienmitglieder BLM und Sgs1, arbeitet in einem Top3-abhängigen Weg, die wahrscheinlich für die genomische Stabilität wichtig ist. Dies ist in unserer letzten Veröffentlichung [1] beschrieben unter<a href="http://www.impactaging.com"> Www.impactaging.com</a>. Detaillierte Beschreibung der Methoden von spezifischen Tests für genetische Komplementierung Studien in Hefe sind in diesem Papier zur Verfügung gestellt.
Protocol
Discussion
Eine der Stärken der Verwendung von Hefe als Modellsystem ist die Verfügbarkeit von Mutanten in definierten DNA-Replikation und-Reparatur-Reaktionswege, die zwischen Hefe und Mensch konserviert sind. Weitere Auswahl von Transformanten, die bestimmte Gene ist einfach und zuverlässig wie die Laborstämme auxotrophen Mutanten und Vektoren mit auxotrophen Marker sind leicht verfügbar sind. Mit Hilfe dieser Vektoren die Expression von Genprodukten kann, indem man sie unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors (zB …
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde in voller Höhe durch die Interne Forschungsprogramm des NIH, National Institute on Aging unterstützt. Wir danken Dr. Rodney Rothstein (Columbia University) für die Hefestämme und Dr. Brad Johnson (University of Pennsylvania School of Medicine, Philadelphia, Pennsylvania) für die SGS1 Expressionsplasmid.
Referências
- Aggarwal, M., Brosh, R. M. WRN helicase defective in the premature aging disorder Werner Syndrome genetically interacts with Topoisomerase 3 and restores the top3 slow growth phenotype of sgs1 top3. Aging. 1, 219-233 (2009).
- Gangloff, S., McDonald, J. P., Bendixen, C., Arthur, L., Rothstein, R. The yeast type I topoisomerase Top3 interacts with Sgs1, a DNA helicase homolog: a potential eukaryotic reverse gyrase. Mol Cell Biol. 14, 8391-8398 (1994).
- Shor, E., Gangloff, S., Wagner, M., Weinstein, J., Price, G., Rothstein, R. Mutations in homologous recombination genes rescue top3 slow growth in Saccharomyces cerevisiae. Genética. 162, 647-662 (2002).
- Sharma, S., Sommers, J. A., Brosh, R. M. In vivo function of the conserved non-catalytic domain of Werner syndrome helicase in DNA replication. Hum Mol Genet. 13, 2247-2261 (2004).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure. Yeast. 11, 355-360 (1995).
- von Kobbe, C., Thoma, N. H., Czyzewski, B. K., Pavletich, N. P., Bohr, V. A. Werner syndrome protein contains three structure specific DNA binding domains. J Biol Chem. 278, 52997-53006 (2003).
