Automatisierte Microfluidic Blut Lysis-Protokoll zur Anreicherung von zirkulierenden Zellen mit Zellkern

Summary

Ein automatisiertes mikrofluidischen Gerät wurde für den Umlauf kernhaltigen Zelle Bereicherung aus dem peripheren Blut über Erythrozytenlyse dass die Isolierung von hoher Qualität Probe stellt sicher, ohne Zellverlust entwickelt.

Abstract

In diesem Bericht das Protokoll für ein automatisiertes mikrofluidischen Blut Lyse Gerät ist detailliert. Zirkulierende kernhaltigen Zellen (CNCs), einschließlich Leukozyten und Endothelzellen, bieten eine ideale Plattform, um einen aktualisierten Status auf das Immunsystem Zustand eines Individuums. Die Mikrofluidik-Protokoll ermöglicht die Anreicherung von CNCs ohne selektive Zellverlust und Probenvorbereitung Variabilität durch Benutzer-vermittelten Schritte. Kurz gesagt, enthält das Protokoll Bauelementherstellung, Probenentnahme-, Geräte-Setup, und läuft das Blut durch den mikrofluidischen Kammer. Innerhalb des Gerätes Vollblut wird schnell mit VE-Wasser für ca. 10 Sekunden in eine 50 micron x 150 micron mikrofluidischen Kanal gemischt. In dieser Zeitspanne werden die Erythrozyten durch hypotone Bedingungen lysiert. Herringbone Strukturen auf dem Boden des Kanals eine gute Durchmischung und Exposition von Zellen, um eine konstante Umgebung. Verbleibende Zellen sind auf isotone Bedingungen an der Ausfahrt des Gerätes zurück, fixiert mit 2% Paraformaldehyd, zentrifugiert, um Erythrozyten Trümmer CNCs trennen und suspendiert in Flow-Puffer für die Färbung und Analyse mittels Durchflusszytometrie. Die Ergebnisse zeigen, sauber Durchflusszytometrie Streudiagramme mit CNC Populationen gerettet. Bedeutung dieses Gerät und Protokoll kommt in der Studie und das Verständnis der Pathogenese der Erkrankung durch eine Analyse der CNC Populationen. Daher sind Automatisierung, Effizienz und Einfachheit der mikrofluidischen Protokoll demonstriert.

Protocol

Teil 1. Microfluidic Bauelementherstellung Ein Silizium-Master-Form der mikrofluidischen Lyse Gerät wurde mit Standard-Photolithographie-Techniken mit dem Gerät in der University of Louisville Reinraum [1]. AutoCAD (Autodesk, Inc., San Rafael, CA) wurde verwendet, um eine Transparenz-Maske erzeugen (Fineline Imaging, Colorado Springs, CO) zu negativen Repliken der Kanäle zu erstellen. Die mikrofluidischen Lyse Gerät wurde von der Silizium-Master-Form mit weichen lithographischen Techniken …

Discussion

Ein automatisiertes mikrofluidischen Blut Lyse-Protokoll wurde berichtet. Im Rahmen des Protokolls sind wichtige Schritte erwähnenswert. In Abschnitt P.2.1, ist es wichtig, das erste Blut Fläschchen, da die Probe enthält verdrängt reife Endothelzellen als Fehlalarme gesammelt zu verwerfen. Stellen Sie außerdem sicher, dass die Blutprobe innerhalb einer Stunde nach Probenentnahme durchgeführt. Priming der mikrofluidischen Gerät in Abschnitt P.2.2, ist es wichtig, zunächst der Blasen zu befreien. Darüber hinaus s…

Materials