Protocolo de Lise automatizado microfluídicos de sangue para Enriquecimento de células nucleadas circulantes

Resumo

Um dispositivo automático microfluídicos foi desenvolvido para a circulação de enriquecimento de células nucleadas do sangue periférico, através de lise de eritrócitos que garante o isolamento de amostras de alta qualidade sem perda de células.

Resumo

Neste relatório, o protocolo para um dispositivo de lise microfluídicos sangue automatizado é detalhado. Circulantes de células nucleadas (CNCs), incluindo leucócitos e células endoteliais, fornecem a plataforma ideal para um status atualizado sobre o estado imunológico de um indivíduo. O protocolo permite microfluídicos para o enriquecimento de CNCs sem perda seletiva de células e preparação de amostras a variabilidade devido ao usuário mediada por etapas. Resumidamente, o protocolo inclui a fabricação de dispositivos, coleta de amostras, a configuração de dispositivos e executando o sangue através da câmara microfluídicos. Dentro do dispositivo de sangue total é rapidamente misturada com água deionizada por cerca de 10 segundos em um x 50 150 micron micron canais microfluídicos. Neste tempo eritrócitos são lisados ​​período devido às condições hipotônica. Estruturas de espinha de peixe na parte inferior do canal de garantir a mistura completa e exposição de células a um ambiente constante. Células restantes são devolvidos às condições isotônicas na saída do dispositivo, fixa usando paraformaldeído 2%, centrifugado para separar fragmentos de eritrócitos de CNCs, e suspenso em tampão de fluxo para a coloração e análise por citometria de fluxo. Os resultados mostram limpa fluxo parcelas citometria de dispersão com populações CNC salvo. Importância deste dispositivo e protocolo vem no estudo e compreensão da patogênese da doença através da análise de populações CNC. Por isso, a automação, a eficácia ea simplicidade do protocolo microfluídicos são demonstradas.

Protocolo

Parte 1. Fabricação de dispositivos microfluídicos

Um molde mestre de silício do dispositivo lise microfluídicos foi criado usando técnicas de fotolitografia com o equipamento na Universidade de Louisville salas limpas [1]. AutoCAD (Autodesk, Inc., San Rafael, CA) foi utilizado para gerar uma máscara de transparência (Fineline Imaging, Colorado Springs, CO) para criar réplicas negativas dos canais. O dispositivo foi fabricado lise microfluídica do molde mestre de silício usando técnicas litográficas suaves com o elastômero poli (dimetilsiloxano) (PDMS; Dow Corning, Midland, MI). O elastômero com os canais replicado foi lançado, e orifícios ....

Discussão

Um protocolo de lise automatizado microfluídicos de sangue tem sido relatado. No âmbito do protocolo são passos críticos dignos de nota. Na seção P.2.1, é importante para descartar o frasco de sangue coletadas primeira vez que a amostra contém células endoteliais desalojado madura agindo como falsos positivos. Certifique-se também para executar o amostra de sangue dentro de uma hora da coleta. Priming o dispositivo microfluídicos na seção p.2.2, é importante inicialmente livrar das bolhas. Além disso, deve-se evitar a i.......