Het meten van plasma membraaneiwit endocytische de tarieven door Omkeerbare biotinylatie
Summary
Gereglementeerde endocytose regelt de cel oppervlakte-expressie niveaus van de meerderheid van de membraaneiwitten. Hier maken wij gebruik van herleidbaar, membraan impermeant biotinylatie reagentia aan de endocytische koers van de dopamine transporter (DAT), een membraaneiwit polytopic te meten. De methode maakt een directe benadering van het meten van de endocytische snelheid van de meeste plasma-membraan eiwitten.
Abstract
Plasmamembraan eiwitten zijn een grote en diverse groep van eiwitten bestaat uit receptoren, ionenkanalen, transporteurs en pompen. De activiteit van deze eiwitten is verantwoordelijk voor een verscheidenheid van belangrijke cellulaire gebeurtenissen, zoals de afgifte van voedingstoffen, cellulaire prikkelbaarheid, en chemische signalen. Veel plasma-membraan-eiwitten worden dynamisch geregeld door endocytische mensenhandel, die proteïne functie moduleert door het veranderen van eiwit-oppervlakte-expressie. De mechanismen die eiwitten endocytose te vergemakkelijken zijn complex en niet volledig begrepen voor veel membraaneiwitten. Om ten volle te begrijpen van de mechanismen die de endocytische handel in een bepaald eiwit controle, is het essentieel dat het eiwit s endocytische snelheid nauwkeurig worden gemeten. Voor veel receptoren, zijn directe endocytische rate metingen vaak bereikt gebruik te maken van het label receptor liganden. Echter, voor vele klassen van membraaneiwitten, zoals vervoerders, pompen en ion kanalen, is er geen geschikte ligand dat gebruikt kan worden om de endocytische meten. In dit rapport beschrijven we een omkeerbare biotinylatie methode die we gebruiken om de dopamine transporter (DAT) endocytische meten. Deze methode biedt een eenvoudige benadering van het meten van internalisatie tarieven, en kan gemakkelijk worden gebruikt voor handel in studies van de meeste membraaneiwitten.
Protocol
Discussion
Vaak voorkomende problemen: Het meest voorkomende probleem dat zich voordoet in deze experimenten is slecht strip efficiency. De efficiëntie van de strip is van cruciaal belang in de mogelijkheid om de resultaten te interpreteren. Tenzij de strip was zeer efficiënt, is het niet mogelijk te concluderen dat elke gebiotinyleerde eiwitten in de internalisatie lanen waren in feite, geïnternaliseerd van het oppervlak. Strips ≥ 90% rendement zijn optimaal, en wij gooi alle resultaten als de strip een lager niveau. …
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door NIH subsidie # DA15169 om HEM
Referências
- Holton, K. L., Loder, M. K., Melikian, H. E. Nonclassical distinct endocytic signals dictate constitutive and PKC-regulated neurotransmitter transporter internalization. Nat Neurosci. 8, 881-888 (2005).
- Boudanova, E., Navaroli, D. M., Melikian, H. E. Amphetamine-induced decreases in dopamine transporter surface expression are protein kinase C-independent. Neuropharmacology. 54, 605-612 (2008).
- Boudanova, E., Navaroli, D. M., Stevens, Z., Melikian, H. E. Dopamine transporter endocytic determinants: carboxy terminal residues critical for basal and PKC-stimulated internalization. Mol Cell Neurosci. 39, 211-217 (2008).
- Loder, M. K., Melikian, H. E. The dopamine transporter constitutively internalizes and recycles in a protein kinase C-regulated manner in stably transfected PC12 cell lines. J Biol Chem. 278, 22168-22174 (2003).
