מדידת חלבון ממברנה פלזמה חליפין Endocytic ידי Biotinylation הפיך
Summary
אנדוציטוזה מוסדרים מסדיר את שטח פני התא רמות הביטוי של רוב חלבונים בממברנה. כאן אנו מנצלים פריק, impermeant קרום biotinylation ריאגנטים למדוד את קצב endocytic של טרנספורטר דופאמין (DAT), חלבון הממברנה polytopic. השיטה מאפשרת גישה פשוטה למדידת קצב endocytic של רוב החלבונים פלזמה הממברנה.
Abstract
חלבונים פלזמה הממברנה הם קבוצה גדולה, מגוונת של חלבונים מורכבת של קולטנים, תעלות יונים, מובילי ומשאבות. פעילות של חלבונים אלה אחראי למגוון של אירועים הסלולר מפתח, כולל אספקת חומרי מזון, רגישות הסלולר, ואותות כימיים. רבים קרום חלבונים פלזמה מוסדרים באופן דינמי על ידי סחר endocytic, אשר מודולציה תפקוד החלבון על ידי שינוי פני השטח ביטוי חלבון. המנגנונים המאפשרים אנדוציטוזה חלבונים מורכבים אינם מובנים במלואם עבור חלבונים בממברנה רבים. כדי להבין את המנגנונים ששולטים בסחר endocytic של חלבון מסוים, זה קריטי, כי שיעור endocytic של חלבון להימדד בדיוק. עבור קולטנים רבים, ישיר מדידות קצב endocytic מושגות לעתים קרובות ניצול ligands קולטן שכותרתו. עם זאת, עבור שיעורים רבים של חלבונים בממברנה, כגון מובילי, משאבות תעלות יונים, אין ליגנד נוח כי ניתן להשתמש כדי למדוד את קצב endocytic. בדו"ח הנוכחי, אנו מתארים שיטה biotinylation הפיך שאנו מעסיקים כדי למדוד את טרנספורטר דופאמין (DAT) שיעור endocytic. שיטה זו מספקת גישה פשוטה למדידת שיעורי הפנמה, והוא יכול בקלות להיות מועסק ללימודי סחר של חלבונים בממברנה ביותר.
Protocol
Discussion
בעיות נפוצות: הבעיה הנפוצה ביותר שעולה בניסויים אלה הוא יעילות רצועת עניים. את היעילות של הרצועה הוא קריטי להיות מסוגל לפרש את התוצאות. אם הרצועה היתה היעילה ביותר, לא ניתן להסיק כי כל החלבונים biotinylated בסמטאות הפנמה היו, למעשה, הפנימו מפני השטח. רצועות ≥ יעילות 90% ה?…
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי מענק NIH # DA15169 אל שולי
Referências
- Holton, K. L., Loder, M. K., Melikian, H. E. Nonclassical distinct endocytic signals dictate constitutive and PKC-regulated neurotransmitter transporter internalization. Nat Neurosci. 8, 881-888 (2005).
- Boudanova, E., Navaroli, D. M., Melikian, H. E. Amphetamine-induced decreases in dopamine transporter surface expression are protein kinase C-independent. Neuropharmacology. 54, 605-612 (2008).
- Boudanova, E., Navaroli, D. M., Stevens, Z., Melikian, H. E. Dopamine transporter endocytic determinants: carboxy terminal residues critical for basal and PKC-stimulated internalization. Mol Cell Neurosci. 39, 211-217 (2008).
- Loder, M. K., Melikian, H. E. The dopamine transporter constitutively internalizes and recycles in a protein kinase C-regulated manner in stably transfected PC12 cell lines. J Biol Chem. 278, 22168-22174 (2003).
