Taxas de medição de plasma Proteína de membrana endocítica por Biotinilação reversível

Resumo

Endocitose regulada governa o celular níveis de expressão de superfície da maioria das proteínas da membrana. Aqui nós utilizamos redutível, membrana reagentes Biotinilação impermeant para medir a taxa endocítica do transportador de dopamina (DAT), uma proteína de membrana politópica. O método facilita uma abordagem simples para medir a taxa de proteínas mais endocítica membrana plasmática.

Resumo

Proteínas da membrana plasmática são um grupo grande e diverso de proteínas composta de receptores, canais iônicos, transportadores e bombas. Atividade dessas proteínas é responsável por uma série de eventos-chave de celulares, incluindo a entrega de nutrientes, excitabilidade celular e sinalização química. Muitas proteínas da membrana plasmática são dinamicamente reguladas, por tráfico endocítica, que modula a função das proteínas, alterando a expressão de proteínas de superfície. Os mecanismos que facilitam a endocitose de proteínas são complexos e não são totalmente compreendidos por proteínas da membrana muitos. A fim de compreender totalmente os mecanismos que controlam o tráfico endocítica de uma determinada proteína, é fundamental que a taxa de endocítica a proteína s ser medido com precisão. Para muitos receptores, direta medições taxa endocítica são freqüentemente alcançados utilizando ligantes receptores rotulados. No entanto, para muitas classes de proteínas da membrana, como os transportadores, bombas e canais iônicos, não há ligante conveniente que pode ser usado para medir a taxa de endocítica. No presente relatório, nós descrevemos um método reversível Biotinilação que nós empregamos para medir o transportador de dopamina (DAT) taxa de endocítica. Este método fornece uma abordagem simples para medir as taxas de internalização, e pode ser facilmente empregada para estudos de tráfico de proteínas mais de membrana.

Protocolo

Resumo procedimento:

Usando essa abordagem, proteínas de superfície celular são covalentemente marcado com biotina na extracelular resíduos de lisina disponível usando um impermeant membrana, dissulfeto-coupled reagente Biotinilação (sulfo-NHS-SS-biotina), sob o tráfico de condições restritivas (ou seja, de baixa temperatura) (ver Fig. 1. para ilustração). Um conjunto de células é deslocado para o tráfico de condições permissivas (37 ° C) e proteínas biotiniladas internalizar. O outro conjunto de células são mantidos em baixas temperaturas como controles para 1) proteína de superfície do total em tempo = 0, e 2) controle de stripping. Após ....

Discussão

Problemas comuns: O problema mais comum que surge nesses experimentos é a eficiência strip pobres. A eficiência da tira é fundamental para ser capaz de interpretar os resultados. A menos que a faixa foi altamente eficiente, não é possível concluir que todas as proteínas biotiniladas nas pistas internalização foram, de fato, internalizados a partir da superfície. Tiras ≥ 90% de eficiência são ótimas, e descartar qualquer resultado, se a tira cair abaixo deste nível. Um exemplo de uma tira de pobres é mostrado na F.......