הדמיה חיה של תסיסנית melanogaster Hemocyte נדידות עובריים
Summary
Hemocytes תסיסנית לפזר מעל מכלול של העובר המתפתח. פרוטוקול זה מדגים כיצד הר התמונה באמצעות העברות אלה עוברים עם hemocytes שכותרתו fluorescently.
Abstract
תא מחקרים רבים כתובת הגירה באמצעות<em> במבחנה</emשיטות>, ואילו הסביבה רלוונטי מבחינה פיזיולוגית הוא זה של האורגניזם עצמו. כאן אנו מציגים פרוטוקול של הרכבה<em> תסיסנית melanogaster</em> עוברים הדמיה לחיות הבאות של hemocytes שכותרתו fluorescently, מקרופאגים עובריים של האורגניזם הזה. שימוש במערכת Gal4-כטב"מ<sup> 1</sup> אנחנו נוסעים הביטוי של מגוון, סמנים מקודדים גנטית מתויג fluorescently ב hemocytes לעקוב פיזור ההתפתחות שלהם לאורך העובר. בעקבות אוסף של עוברים בשלב הרצויה של פיתוח, סיסית החיצוני היא להסיר את העוברים הם רכובים אז בשמן halocarbon בין הידרופובי, גז קרום חדיר ו coverslip זכוכית הדמיה לחיות. בנוסף פרמטרים נודדות ברוטו כגון מהירות כיווניות, הדמיה ברזולוציה גבוהה יותר בשילוב עם השימוש כתבים הניאון של ה-F-אקטין microtubules יכולים לספק מידע מפורט יותר לגבי הדינמיקה של רכיבים אלה cytoskeletal.
Protocol
Discussion
האלמנטים החשובים ביותר של הליך זה הם מבחר של עוברים בריאים עם hemocytes שכותרתו ברורה לעלות אותם בזהירות מבלי לפגוע בהם. פעם הם עוברים בשמן halocarbon הם עמידים בפני התייבשות רכוב פעם ניתן הדמיה במשך כמה שעות. בידיים שלנו אנחנו hemocytes תמונה במשך שלוש שעות, עם התייבשות זניח של הע?…
Acknowledgements
פרוטוקול זה פותח דרך העבודה שלנו בתוך בשיתוף עם מעבדות של פול מרטין ואנטוניו חסינטו. אנו מודים מרכז במלאי Bloomington עבור שירות מעולה שלה ושל הקהילה תסיסנית להמשך לשתף קווי לעוף. BS ממומנת כרגע על ידי מענק לפרויקט BBSRC. WW ממומנת על ידי מלגה האמון Wellcome פיתוח קריירה.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Cell strainer | BD Falcon | 352350 | 70μm pores | |
| Halcarbon oil 700 | Sigma | H8898 | ||
| Lumox/Petriperm dish | Sarstedt | 96077305 |
Referências
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Bruckner, K. The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila. Dev Cell. 7, 73-84 (2004).
- Dutta, D., Bloor, J. W., Ruiz-Gomez, M., VijayRaghavan, K., Kiehart, D. P. Real-time imaging of morphogenetic movements in Drosophila using Gal4-UAS-driven expression of GFP fused to the actin-binding domain of moesin. Genesis. 34, 146-151 (2002).
- Stramer, B. Live imaging of wound inflammation in Drosophila embryos reveals key roles for small GTPases during in vivo cell migration. J Cell Biol. 168, 567-573 (2005).
- Wood, W., Jacinto, A. Drosophila melanogaster embryonic haemocytes: masters of multitasking. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 542-551 (2007).
- Halfon, M. S. New fluorescent protein reporters for use with the Drosophila Gal4 expression system and for vital detection of balancer chromosomes. Genesis. 34, 135-138 (2002).
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. . Drosophila protocols. , (2000).
- Tepass, U., Fessler, L. I., Aziz, A., Hartenstein, V. Embryonic origin of hemocytes and their relationship to cell death in Drosophila. Development. 120, 1829-1837 (1994).
- Millard, T. H., Martin, P. Dynamic analysis of filopodial interactions during the zippering phase of Drosophila dorsal closure. Development. 135, 621-626 (2008).
- Doerflinger, H., Benton, R., Shulman, J. M., St Johnston, D. The role of PAR-1 in regulating the polarised microtubule cytoskeleton in the Drosophila follicular epithelium. Development. 130, 3965-3975 (2003).
- Olofsson, B., Page, D. T. Condensation of the central nervous system in embryonic Drosophila is inhibited by blocking hemocyte migration or neural activity. Dev Biol. 279, 233-243 (2005).
- Paladi, M., Tepass, U. Function of Rho GTPases in embryonic blood cell migration in Drosophila. J Cell Sci. 117, 6313-6326 (2004).
- Vlisidou, I. Drosophila embryos as model systems for monitoring bacterial infection in real time. PLoS Pathog. 5, e1000518-e1000518 (2009).
- Jacinto, A. Dynamic actin-based epithelial adhesion and cell matching during Drosophila dorsal closure. Curr Biol. 10, 1420-1426 (2000).
- Wood, W., Jacinto, A. Imaging cell movement during dorsal closure in Drosophila embryos. Methods Mol Biol. 294, 203-210 (2005).
- Kunwar, P. S. Tre1 GPCR initiates germ cell transepithelial migration by regulating Drosophila melanogaster E-cadherin. J Cell Biol. 183, 157-168 (2008).
