मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर का उपयोग कर थर्मो वैज्ञानिक Solaris qPCR परख

Summary

Solaris qPCR जीन अभिव्यक्ति assays उपन्यास पूर्व डिजाइन qPCR / प्राइमर जांच के लिए विशिष्टता और परख की मजबूती त्याग के बिना qPCR प्रक्रिया को सरल डिजाइन संयोजन कर रहे हैं.

Abstract

Solaris qPCR जीन अभिव्यक्ति परख प्राइमर / जांच सेट के एक उपन्यास प्रकार, qPCR प्रक्रिया को सरल करते हुए और परख की संवेदनशीलता और सटीकता बनाए रखने के लिए डिज़ाइन है. इन / प्राइमर जांच सेट कर रहे हैं> मानव और चूहे और पहले से उपलब्ध प्रौद्योगिकियों से जीनोम सुविधा महत्वपूर्ण सुधार के 98% के लिए पूर्व बनाया गया. ये सुधार एक उपन्यास डिजाइन, एल्गोरिथ्म, थर्मो वैज्ञानिक जैव सूचना विज्ञान विशेषज्ञों द्वारा विकसित की पुण्य से ही संभव बनाया गया.

Solaris qPCR परख मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर प्रदर्शन करने की प्रक्रिया को कारगर बनाने में कई सुविधाजनक सुविधाओं को शामिल किया गया है. सबसे पहले, प्रोटोकॉल आमतौर पर कार्यरत विकल्प के समान है, तो qPCR के दौरान इस्तेमाल किया तरीकों से परिचित होने की संभावना हैं. दूसरा, गुरु मिश्रण नीला है, जो qPCR प्रतिक्रियाओं को ट्रैक करने के लिए आसान की स्थापना करता है. तीसरा, थर्मल साइकिल की स्थिति सभी assays के लिए एक ही (जीन) कर रहे हैं, यह एक समय में कई नमूने को चलाने के लिए संभव बनाने और त्रुटि के लिए क्षमता को कम करने. अंत में, जांच और प्राइमर अनुक्रम जानकारी प्रदान कर रहे हैं, प्रकाशन की प्रक्रिया को सरल बनाने.

यहाँ, हम प्रदर्शन कैसे प्राप्त करने के लिए उपयुक्त Solaris GENEius उत्पाद खोज (www.thermo.com / solaris) आदेश वेब साइट पर और qPCR प्रदर्शन मानक वक्र विधि का उपयोग करने के लिए Solaris अभिकर्मकों उपयोग कैसे पाया सुविधा का उपयोग कर अभिकर्मकों.

Protocol

1. थर्मो वैज्ञानिक Solaris qPCR परख डिजाइन एलगोरिदम Solaris qPCR / जांच प्राइमर जोड़े के डिजाइन में इस्तेमाल किया एल्गोरिथ्म प्रत्येक जिससे सार्वभौमिक साइकिल चालन की स्थिति को सक्षम घटक के Tm समायोजित कर देता है. MGB के समावेश, या मामूली नाली बंधन, जांच में आधा भाग Tm को बढ़ाता है और कम अधिक परख लचीलापन और प्रदर्शन के लिए तैयार हो जांच के लिए अनुमति देता है. के रूप में उनके नाम का अर्थ है, MGBs एंटीबायोटिक दवाओं का एक वर्ग है कि डीएनए हेलिक्स के मामूली नाली में फिट कर सकते हैं कर रहे हैं. MGBs एक डीएनए जांच की 3 या 5 को समाप्त करने के लिए संलग्न कर रहे हैं. समाधान में, जांच के परिवार संवाददाता प्रतिदीप्ति ग्रहण डार्क पेय द्वारा बुझती है. जब जांच लक्ष्य अनुक्रम को बांधता है, जांच रचना 3 – डी में जिसके परिणामस्वरूप परिवर्तन एक मजबूत फ्लोरोसेंट संकेत की अनुमति देता है. MGB, जो अत्यधिक विशिष्ट, छोटे जांच के उपयोग की अनुमति देता है, जबकि पीसीआर के लिए उपयुक्त तापमान के पिघलने को बनाए रखने द्वारा लक्ष्य अनुक्रम डीएनए जांच के बंधन स्थिर है. इस प्रकार, संकेत का पता लगाने के लक्ष्य प्रवर्धन के annealing के चरण के दौरान होता है. विस्तार चरण के दौरान, MGB जांच disassociates और प्रतिदीप्ति फिर बुझती है. क्योंकि जांच disassociates, यह पीसीआर दक्षता प्रभावित नहीं करता है. Solaris एल्गोरिथ्म के एक अन्य विशेषता Superbases का उपयोग है. Superbases अड्डों है कि बाध्यकारी क्षमताओं को बढ़ाया है बांड एटी की स्थिरता में सुधार और जी जी guanine अमीर दृश्यों में आत्म – संघ को खत्म करने को संशोधित कर रहे हैं. इसके अलावा, वे आसन्न 5 टर्मिनस पर संलग्न fluorophores नहीं बुझाने करते हैं. इन अड्डों चुनिंदा एल्गोरिथ्म के अनुसार रखा जाता है, लक्ष्य दृश्यों की उपलब्धता का विस्तार. इस जीसी समृद्ध क्षेत्रों के रूप में इस तरह के दृश्यों, कि अन्यथा प्राइमरों और जांच डिजाइन में बचा होगा उपयोग करने के लिए यह संभव बनाता है. जब भी संभव हो, सोलारिस एल्गोरिथ्म एक्सॉन लक्षित साइट में जंक्शन फैले क्षेत्रों को शामिल किया. यह contaminant जीनोमिक डीएनए के प्रवर्धन से बचने के द्वारा विशिष्टता बढ़ जाती है. महत्वपूर्ण बात है, एल्गोरिथ्म भी सभी ज्ञात ब्याह वेरिएंट के लिए एक आम सहमति अनुक्रम, जैसे कि सभी एक एकल / जांच प्राइमर सेट द्वारा कवर कर रहे हैं की पहचान. तो, केवल एक परख ब्याज की एक विशेष जीन के लिए की जरूरत है. अंत में, Solaris qPCR परख डिजाइन एल्गोरिथ्म जीसी सामग्री, लंबाई, टीएम, और समरूप nucleotides के हिस्सों सहित बहुत कड़े महत्वपूर्ण डिजाइन विचार के लिए मानकों का इस्तेमाल करता. जीनोमिक, प्रतिलेख, और pseudogene: परिणामस्वरूप दृश्यों विशिष्टता के लिए 3 अलग डेटाबेस का उपयोग विश्लेषण ब्लास्ट कर रहे हैं. 2. Solaris अभिकर्मकों प्राप्त उपयुक्त Solaris अभिकर्मकों प्राप्त करने के लिए, यात्रा www.thermo.com / solaris एक बार वेबसाइट पर "GENEius उत्पाद खोज" पर क्लिक करें. GENEius उत्पाद खोज करने के लिए सीधे जाने के लिए जाना / www.thermo.com SolarisSearch खोज पूछताछ बॉक्स में क्लिक करें और उचित लक्ष्य जीव चुन. GENEius उत्पाद खोज कई अलग अलग जीन पहचानकर्ता प्रक्रिया कर सकते हैं. यहाँ, एक सुझाव दिया खोज करने के लिए रेफरी Seq परिग्रहण, जीन आईडी, जीन प्रतीक, एक जीन का विवरण, सेंगर ID या परिग्रहण संख्या, या एक सूची नंबर सहित, ब्याज की जीन खोजने शर्तों के प्रवेश. फिर, "खोज" पर क्लिक करें. ब्याज की जीन को पहचानें और बाएं हाथ की ओर "चुनें" पर क्लिक करें. यह एक खिड़की है कि विभिन्न थर्मो वैज्ञानिक हित के जीन के लिए उपलब्ध उत्पादों से पता चलता है खुल जाएगा. "उत्पाद" के अंतर्गत "qPCR जांच" टैब का चयन करें. "Solaris जीन एक्सप्रेशन परख" शीर्षक के अंतर्गत, आप देखेंगे एक बेहतर Solaris जांच / प्राइमर परख डिजाइन. यह एक परख अपने जीन लक्ष्य के सभी ज्ञात ब्याह वेरिएंट को कवर किया जाएगा. वांछित मात्रा चुनें. वे 100, 200, 400 में उपलब्ध हैं, और 1000 X 25 μl प्रतिक्रियाओं (अगर परख बनाया करने के आदेश के रूप में पहचान की है, 100 पैकेट का आकार उपलब्ध नहीं होगा). "कार्ट में जोड़ें" पर क्लिक करें. अगला, थर्मल cycler है कि इस्तेमाल किया जा जाएगा के लिए उपयुक्त मास्टर मिश्रण का चयन करें. यह निर्धारित करने के लिए जो मास्टर मिश्रण उपलब्ध मशीन के साथ सबसे अच्छा काम करेंगे, पर क्लिक करें "बाहर का पता लगाएं, जो मास्टर मिक्स अपने पीसीआर Cycler के साथ सबसे अच्छा काम करता है!" QPCR cycler है कि मेनू पर इस्तेमाल किया जाएगा निर्धारित करने के लिए जो का उपयोग करने के लिए मिश्रण का पता लगाएं. GENEius उत्पाद खोज खिड़की पर लौटें, और उचित मास्टर मिश्रण चुनें. मास्टर मिश्रण 100, 200, 400, और 1000 प्रतिक्रिया आकार में आता है. "कार्ट में जोड़ें" पर क्लिक करें. सुझाव संदर्भ जीन और पीठ सीडीएनए संश्लेषण किट भी एक पूरा विश्लेषण QRT-पीसीआर के लिए आदेश दिया जा सकता है. जब Solaris qPCR अभिकर्मकों पहुंचें, उपयोग के लिए तैयार है जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें दुकान. निम्नलिखित अभिकर्मकों प्राप्त होना चाहिए: एक 20X दो प्राइमरों 800 प्रत्येक और एक जीन विशिष्ट 200 एनएम, sequ पर उपलब्ध कराई गई जांच एनएम प्रदान युक्त समाधानदोनों जांच और प्राइमरों, और Solaris qPCR एक 2X एकाग्रता में जीन एक्सप्रेशन मास्टर मिक्स के लिए खिलाडि़यों की जानकारी. Solaris qPCR जीन अभिव्यक्ति assays 12 महीने की एक न्यूनतम के लिए स्थिर रहे हैं. दोहराया फ्रीज विगलन से बचें. 3. qPCR सेटअप सीडीएनए के साथ qPCR प्रोटोकॉल शुरू करो. कुल शाही सेना एक स्पिन स्तंभ पद्धति का उपयोग करके निकाला जाना चाहिए. थर्मो वैज्ञानिक वर्सो सीडीएनए संश्लेषण किट रिवर्स प्रतिलेखन सीडीएनए उत्पन्न करने के लिए सिफारिश की है. प्राइमरों, जांच, और बर्फ पर मास्टर मिश्रण विगलन द्वारा qPCR के लिए तैयार है. इसके अलावा हाथ पर पीसीआर ग्रेड पानी और अपारदर्शी सफेद qPCR प्लेटें, जो वास्तविक समय पीसीआर की संवेदनशीलता में सुधार कर सकते हैं. ) 1 थर्मो प्रारंभ पोलीमरेज़ डीएनए, Thermoprime डीएनए पोलीमरेज़ एक गर्म शुरू संस्करण: मास्टर मिश्रण सहित वास्तविक समय पीसीआर के लिए सभी घटक शामिल हैं. पोलीमरेज़ के इस प्रकार प्रतिक्रिया सेट के दौरान गैर विशिष्ट प्रवर्धन को रोकने के लिए प्रयोग किया जाता है और 95 पर सक्रियण कदम ° 15 सी मिनट की आवश्यकता है. 2) Solaris मास्टर मिश्रण में dNTPs, dTTP प्रवर्धन दक्षता 3) स्वामित्व प्रतिक्रिया बफर, सोलारिस / प्राइमर जांच assays के साथ काम करने के लिए अनुकूलित अधिकतम dUTP बदलता है. इस प्रतिक्रिया बफर नीले डाई शामिल अभिकर्मक और प्लास्टिक के बीच विपरीत वृद्धि. 4) Rox, अगर आपके qPCR साधन की आवश्यकता Rox. एक बार समाधान thawed है, ट्यूब (भंवर नहीं है) flicking द्वारा मिश्रण. उन्हें स्पिन नीचे अभिकर्मक के नुकसान को रोकने के. अगले, एक 15 एमएल बाँझ फाल्कन ट्यूब तैयार करने के लिए ब्याज की जीन, प्लस एक संदर्भ जीन के लिए नमूनों की संख्या पर निर्भर करता है स्केलिंग के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण सेट. पर्याप्त तैयार ऐसी है कि तीन प्रतिकृति प्रत्येक नमूना के लिए तैयार किया जा सकता है है, एक नहीं टेम्पलेट (एनटीसी) नियंत्रण और मानक वक्र के नमूने सहित, अगर मानक वक्र विधि विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. प्रत्येक एक 96 अच्छी तरह से थाली पर चलाने के नमूने के लिए, निम्न मिश्रण: 5 μL 2X Solaris qPCR मास्टर मिक्स, Solaris सेट / प्राइमर जांच (20X) के 0.5 μl, और पीसीआर ग्रेड पानी ऐसी है कि अंतिम प्रतिक्रिया की मात्रा एक बार, सीडीएनए 25 μL हो जाएगा करने के लिए जोड़ा जाता है. प्रत्येक नमूना के लिए एक 384 अच्छी तरह से थाली पर चलने निम्नलिखित मिश्रण: 2X Solaris qPCR मास्टर मिक्स के 12.5 μL, सोलारिस सेट / प्राइमर जांच (20X) के 1.25 μl, और पीसीआर ग्रेड जैसे पानी कि अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा, एक बार सीडीएनए है जोडी 10 μL हो जाएगा. एक बहु चैनल pipettor का प्रयोग, थाली के उचित कुओं मास्टर मिश्रण हस्तांतरण. नीले मास्टर मिश्रण में शामिल डाई सफेद प्लेट पर pipetting प्रगति पर नज़र रखने में सहायता करेगा. फिर, 1-5 μL सीडीएनए (एक 96 अच्छी तरह से थाली के लिए) टेम्पलेट या सीडीएनए टेम्पलेट के 1-2 μL (384 अच्छी तरह से थाली के लिए) जोड़ें. पिपेट और नीचे मिश्रण करने के लिए. एक अपकेंद्रित्र में थाली प्लेस और स्पिन से नीचे किसी भी बुलबुले को दूर करने के लिए, के रूप में इन प्रतिदीप्ति रीडिंग के साथ हस्तक्षेप करेगा. कार्यक्रम थर्मल cycler: एंजाइम के साथ सक्रिय होना चाहिए एक 95 ° C 15 मिनट (1 चक्र). फिर 95 के 40 चक्रों डिग्री सेल्सियस, 15 सेकंड के लिए विकृतीकरण, और annealing और 60 पर विस्तार ° C 60 सेकंड के लिए. QPCR साधन में थाली प्लेस. प्रोग्राम प्रारंभ करें. प्रतिनिधि qPCR Solaris का उपयोग कर परिणाम चित्रा 1. Solaris assays बहुत कम इनपुट सांद्रता में भी विश्वसनीय पहचान देते हैं, के रूप में पीसीआर दक्षता और r2 मान के द्वारा न्याय. दस सीडीएनए का 10 गुना dilutions सिंथेटिक शाही सेना amplicon अनुक्रम या डीएनए amplicon अनुक्रम से संश्लेषित एक अबी 7900HT F2RL1 या CDC20, क्रमशः के लिए Solaris qPCR जीन अभिव्यक्ति परख का उपयोग कर साधन पर परिलक्षित किया गया था. लॉग पैमाने प्रवर्धन घटता और मानक घटता के साथ दक्षता, r2 मूल्य, 10 log10 dilutions की गतिशील रेंज बाहर, और पता लगाने की निचली सीमा सहित प्रत्येक परख के प्रदर्शन के साथ दिखाए जाते हैं. चित्रा 2. Solaris Assays विभिन्न शोधकर्ताओं और प्रयोगशालाओं के बीच भी अनुरूप परिणाम दे . siRNAs लक्ष्यीकरण ALDOA और PPIB, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक गैर लक्ष्यीकरण नियंत्रण (एनटीसी) HELA कोशिकाओं में 100, 10, 1, और 0.1 एनएम अंतिम सांद्रता में ट्रांसफ़ेक्ट थे. कक्ष काटा थे और कुल शाही सेना के 48 बजे के बाद इलाज पृथक. सीडीएनए थर्मो वैज्ञानिक वर्सो सीडीएनए संश्लेषण किट का उपयोग कर संश्लेषित किया गया था. सीडीएनए के एक विभाज्य दो भौगोलिक दृष्टि से अलग प्रयोगशालाओं में परिलक्षित किया गया था ALDOA, PPIB, और GAPDH का पता लगाने के के लिए रॉश LightCycler 480 (384 अच्छी तरह से) मंच पर Solaris qPCR जीन अभिव्यक्ति assays का उपयोग कर. नॉकडाउन ΔΔCq विधि (GAPDH संदर्भ जीन और एनटीसी इलाज कोशिकाओं के लिए सामान्यीकृत) का उपयोग कर की गणना की गई. पछाड़ना का एक ही स्तर दोनों स्थलों पर दोनों शोधकर्ताओं के बीच दोनों जीन लक्ष्य के लिए प्रदर्शन किया गया.

Discussion

थर्मो वैज्ञानिक Solaris qPCR Assays एक सरल, qPCR विश्लेषण प्रदर्शन में सुधार के लिए विधि प्रदान करते हैं. एक उच्च तंगी एल्गोरिथ्म का उपयोग, शामिल MGB प्रौद्योगिकी और Superbases, इन प्राइमर और जांच सेट निष्ठा और qPCR प्रयोगों की मजबूती को अधिकतम. एक प्राइमर और जांच सेट किसी जीन के सभी ज्ञात ब्याह वेरिएंट पहचानता है. लक्ष्य जब भी संभव हो, साइट एक्सॉन फैले क्षेत्रों, करने के लिए सुनिश्चित करें कि जीनोमिक डीएनए नहीं परिलक्षित होता है शामिल हैं. इन सुविधाओं यह संभव कई नमूने को चलाने के लिए एक साथ, बहुत जटिल प्रयोगों करने के लिए आवश्यक समय की मात्रा को कम करने के लिए बनाते हैं. के बाद से मास्टर मिश्रण नीला है, यह सफेद अपारदर्शी प्लेटें, जो pipetting का ट्रैक खोने के बिना qPCR की संवेदनशीलता में सुधार का उपयोग करने के लिए संभव है.

सब साथ में ले ली, डिजाइन सुविधाओं Solaris qPCR परख के इस उपन्यास qPCR कि दोनों विशिष्ट और मजबूत है एक सरल, अभी तक उच्च प्रदर्शन परख परख कर.

Materials

Name of the reagent / material	Company	Catalogue Number	Comments
Solaris aPCR Gene Expression ROX Master Mix (Intro Pack Size)	Thermo	AB-4351/INT	100 x 25 μL rxns
Solaris qPCR Gene Expression ROX Master Mix	Thermo	AB-4351/A	200 x 25 μL rxns
Solaris qPCR Gene Expression ROX Master Mix	Thermo	AB-4351/B	400 x 25 μL rxns
Solaris qPCR Gene Expression ROX Master Mix	Thermo	AB-4351/C	1000 x 25 μL rxns
Solaris qPCR Gene Expression Assays	Thermo	AX-XXXXXX-XX-XXXX*	100 rxns (1 x 125 μL) 200 rxns (2 x 125 μL) 400 rxns (4 x 125 μL) or 1000 rxns (10 x 125 μL)
Verso cDNA Synthesis Kit	Thermo	AB-1453/A AB-1453/B	40 x 20 μL rxns 100 x 20 μL rxns
ABgene 96-Well Plate (Skirted, Low Profile, White) **	Thermo	AB-0800/W	25 plates
ABgene Diamond Ultra 384-Well PCR Plate, White **	Thermo	AB-2150/W	25 plates
Absolute qPCR Adhesive Seal	Thermo	AB-1170	50 sheets

*Catalog number is product specific. Please refer to www.thermo.com/solaris to select the appropriate assay

**For cycler compatibility and color choices, see our lates catalog or visit www.thermo.com/pcrplastics